李光*，李学兰，孙慧峰，刀兆玲

（1.中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南 景洪 66610 0；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150 0 40；3.云南中医学院，云南 昆明 650 50 0）

响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件

李光1*，李学兰1，孙慧峰2，刀兆玲3

（1.中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南 景洪 66610 0；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150 0 40；3.云南中医学院，云南 昆明 650 50 0）

目的：应用响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取的最佳工艺条件，为应用于生产提供参考。方法在单因素试验的基础上，采用响应曲面法的中心组合设计，考察分析提取温度、提取时间、提取次数、液料比4个主要因素对石斛多糖提取率的影响，对铁皮石斛多糖的提取工艺参数进行优化分析。结果：铁皮石斛多糖提取的最优条件为：提取温度为10 0℃、提取时间为2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次数为3次。在此条件下，理论计算提取率达到51.12%，实测提取率为51.08%，与模型高度拟合。结论该工艺便捷、快速、易操作、得率较高，可用于铁皮石斛多糖的提取。

铁皮石斛；多糖；响应曲面法；提取工艺

石斛多糖是铁皮石斛Dendro bium officinale Kimuraet migo中最主要的有效成分［1］。现代药理学研究表明，铁皮石斛中石斛多糖具有较强的药理活性［2-5］，具有较高的开发价值。影响铁皮石斛多糖提取率的因素很多，如提取温度、提取时间、提取次数、物料比等，常规优化方法得到的提取工艺不能全面展示各因素间的相互影响，实际操作过程中造成很多产量损失。目前多糖提取工艺研究多采用正交试验设计，但该方法不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域内因素的最佳组合和响应值的最优值。响应曲面法以其试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的诸多优点，在很大程度上满足了这些要求。目前，多种植物多糖都用响应曲面法进行测定［6-7］，都能够优化得到很好的提取率。关于响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取工艺方面的研究尚未见有报道，作者在单因素试验的基础上，采用响应曲面法对铁皮石斛多糖的提取温度、提取时间、提取次数、液料比4个因素的3个水平进行中心组合试验研究，分析得出最佳提取工艺参数，以为今后扩大应用和工业化生产提供依据和参考。

1 材料、仪器与试药

1.1 材料

铁皮石斛 （购自西双版纳增靓生物科技有限公司）。

1.2 仪器

数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司），电子天平 （赛多利斯公司），分析天平 （赛多利斯公司），SHB-I V双A循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），TGL16M湘智离心机 （安徽诚信启动设备有限公司），U V-190 1分光光度计（北京普析仪器有限公司），旋转蒸发器R E-52A（上海亚荣生化仪器厂），GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），玻璃仪器气流烘干箱 （武汉科尔仪器设备有限公司）。

1.3 试药

D-无水葡萄糖对照品 （中国药品生物制品检定所），水为超纯水，乙醚 （分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），无水乙醇 （分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），苯酚 （分析纯，天津市大茂化学试剂厂），浓硫酸 ［重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂］，三氯甲烷 （分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

2 方法

2.1 铁皮石斛多糖提取工艺

精密称取铁皮石斛干燥粉末0.5000g（过3号筛），置圆底烧瓶中，按设定的提取条件 （液料比、提取温度、提取时间、提取次数）进行回流提取，提取时将反应容器置于恒温水浴锅中，提取反应完成后，待料液冷却后通过抽滤进行汁渣分离，弃去沉淀，得多糖浸提液，提取液置250m L容量瓶中定容。

将以上所得的提取液，分别精密量取1m L滤液置10m L的离心管中，精密加入5m L无水乙醇，摇匀，冷藏1h，取出，离心（转速为4000r·min－1）20m i n，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次10m L，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25m L容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

2.2 标准曲线的制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1m L中含90μ g的溶液，精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0m L，分别置10m L具塞试管中，各加水补至1.0m L，精密加入5%苯酚溶液1m L（临用配制），摇匀，再精密加硫酸5m L，摇匀，置沸水浴中加热20m i n，取出，置冰浴中冷却5m i n，以相应试剂为空白，在488nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3 多糖含量测定

采用苯酚－硫酸法［8-9］。

2.4 多糖提取率的计算

2.5 单因素及响应面优化试验设计

通过单因素试验和查阅文献资料确定出提取温度、提取时间、提取次数、料液比对铁皮石斛多糖含量有显著影响，为了选择最佳提取条件，依据单因素试验结果，应用Design Expert8.05b软件进行实验设计，分别考察提取温度、液料比、提取时间和提取次数对铁皮石斛多糖得率的影响并进行优化，详见表1。

表1Box-Behnken设计因素水平表

3 结果

3.1 葡萄糖标准曲线

实验制备葡萄糖标准曲线，得到回归方程A＝100 31C－0.0404，r＝0.9994。回归分析表明，在0.03～0.16m g·m L－1葡萄糖的质量浓度与吸光度呈良好线性关系。

3.2 水提法提取铁皮石斛多糖的单因素影响

3.2.1 提取温度对铁皮石斛多糖提取量的影响 温度直接影响物质在水中的溶解度，因此对多糖提取率会有比较显著的影响。本实验在液料比40∶1、提取时间1.5h、提取3次的条件下，将温度设定在70，75，80，85，90，95，100℃7个温度，研究温度对铁皮石斛多糖提取率的影响，结果见图1。

图1 提取温度对提取率的影响

3.2.2 提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响 在提取温度10 0℃、液料比40∶1、提取3次的条件下，考察提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对提取率的影响

3.2.3 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响 提取温度10 0℃、提取时间2.5h、提取3次的条件下，考察液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 液料比对提取率的影响

3.2.4 提取次数对铁皮石斛多糖提取率的影响 在提取温度10 0℃、液料比30∶1、提取时间2.5h的条件下，考察提取次数对铁皮石斛多糖提取率的影响，结果见图4。

图4 提取次数对提取率的影响

3.3 模拟组合

结果见表2。

表2Box-Behnken设计实验结果 /%

由表2可知，通过对提取温度、提取时间、料液比、提取次数进行试验优化设计，得到相应的二次方程模型：Y＝0.35820＋0.011091A＋0.014902B＋0.0 10343C－9.19026×10－3D＋0.0370 41A B－0.081217AC＋0.06610 8AD－0.042538C2＋3.61557×10－3D2。

表3为试验结果进行拟和的二次模型方差分析，二次模型中回归系数的显著性检验表明，因素C对提取效果的线性效应显著，因素A C对提取效果的交互影响显著。回归F值为3.59，多元相关系数为r＝62.96%，说明模型对试验实际情况拟合较好；P＝0.0091（P＜0.0 1视为模型拟合极显著），表明该模型高度显著，可用来进行响应值的预测，试验设计方案正确。

表3 回归分析结果

3.4 响应曲面与等高线分析

根据回归模型作出相应的响应面和等高线，见图5～7，比较两组图响应面最高点和等高线可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点同时也是等高线最小椭圆的中心点［10］。

通过表3回归分析结果可见，自变量 （提取温度与物料比交互作用、提取温度与提取次数）与响应值（提取率）之间线性关系极显著（P＜0.01），物料比的二项式达到显著水平（P＜0.05）。由表3可知，各因素对多糖提取率的影响顺序：提取温度与液料比交互项＞提取温度与提取次数交互项＞液料比二次项＞提取温度与提取时间交互项＞提取时间一次项＞提取温度一次项＞液料比一次项＞提取次数一次项＞提取次数二次项。

Design-Expert8.0.5软件处理得响应面分析结果见图5～7。由图可知，因素提取温度、提取时间、液料比、提取次数交互影响很复杂，可能是由于在提取过程中多糖出现水解情况造成的。

图5 提取温度与提取时间对多糖提取率的影响

图6 提取温度与液料比对多糖提取率的影响

图7 提取温度与提取次数对多糖提取率的影响

由Design-Expert8.0.5软件得到优化条件的处理，确定最优提取工艺关键因素为提取温度100℃、提取时间2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次数为3次，理论计算提取率达到51.12%。在此基础上进行验证实验，实测提取率51.0 8%，与预测值较接近。

4 讨论

本实验通过响应面试验设计方法考察了提取时间、提取温度、提取次数和液料比对石斛多糖提取率的影响。二次方程的模型 （总）回归极显著差异，且第二次方差分析后的失拟项检验不显著，说明通过本实验所建立的二次回归方程成功地反映了所考察的4个因素与响应值之间的相关性，试验设计科学合理，在提取石斛多糖的过程中提取温度和液料比的交互项影响极显著，实验结果表明，石斛多糖提取工艺过程中，随物料比增加产率降低，这可能是由于石斛多糖溶解性好，少量溶剂就能够很好溶解，由于得到石斛多糖溶液比较黏稠，在过滤过程中损失较大，所以较小液料比能够得到较大得率。最终方程模拟得到石斛多糖提取最佳工艺条件为提取温度100℃、提取时间2.5h、料液比1∶17.2（m/V）、提取次数为3次，理论计算提取率达到51.12%。在此基础上进行验证实验，实测提取率51.08%，与预测值较接近。这种优化提取方法可以在石斛多糖提取工艺研究中进一步推广。

［1］高正华，杨兵勋，陈立钻.铁皮石斛的研究进展［J］.中国现代应用药学杂志，2008，25（8）：692-695.

［2］吕圭源，陈素红，张丽丹，等.铁皮石斛对小鼠慢性酒精性肝损伤模型血清2种转氨酶及胆固醇的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：192-193.

［3］张红玉，戴关海，马翠，等.铁皮石斛多糖对S-（180）肉瘤小鼠免疫功能的影响［J］.浙江中医杂志，2009，44（5）：380-381.

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［5］王令仪.石斛多糖和生物碱测定及多糖抗衰老实验研究［D］.遵义：遵义医学院，2009.

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Optimization of Extraction of Dendrobium candidum Polysaccharides Using Response Surface Methodology

LI Guang1，LIXue-lan1，SUNHui-feng2，DAOZhao-ling3
（1．Yunnan Branch，Institute of medicinal Plant，Chinese Academy of medical Sciences，Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China；2.College of Pharmacy，Heilong jiang University of Trad itional Chinese medicine，Harbin150040，China；3.Yunnan Universityof Traditi onal Chinese medicine，Kun ming650500，China）

Objective：To obtain the optimal conditions of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium candidum，and to provide the theoretical foundation for the further processing and utilization of Dendrobi-um candidum.Methods：On the basis of the single factor test，response surface methodology was applied to optimize the main extraction conditions.Results：The Results showed that extraction time，water-feed ratio and extraction tem-perature all had significant effects on the extraction rate of polysaccharides.Obvious correlation was found to be existed between extraction time and extraction temperature.The optmal extraction time was 2.5h and the optimal water-feed ratio was 17.2，and the optimal extraction temperature was100℃ Under these optimized conditions，the extraction rate of polysaccharides was51.12%.ConclusionMultivariate regression analysis showed that the model of extraction time，water-feed ratio，extraction temperature and extraction rate of polysaccharides could be forecasted by applying the model.

Dendrobium candidum；Response surface methodology（RSm）；Polysaccharides；Ultrasonic extraction

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（YZYN-10-01）

*李光，Tel：（0691）2136981；E-mail：lhbg311＠hotmail.com

2011-06-30）