吴勃岩，孙阳，梁颖，吴勃力，毕克滨，赵文静，裴丽，王艳杰

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

细胞凋亡与肿瘤发生发展的研究已经成为生命科学中的研究热点，诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的重要途径。齐墩果酸(Olesnolic Acid，简称OA)，为三萜类脂溶性活性物质，是一种天然产物化学成分，广泛存在于女贞子、白花蛇舌草、夏枯草、大枣、牛膝、西洋参、连翘、山芝麻、甘草等植物中。齐墩果酸具有多种药理作用，具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫双向调解作用、抑瘤、抗衰老等作用［1］。本文研究齐墩果酸对肉瘤S－180荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡相关基因p53基因、Bcl－2基因表达的影响，探讨抗肿瘤作用机制，为齐墩果酸用于肿瘤治疗提供新的思路和实验数据。

1 材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物、瘤株和试剂

齐墩果酸(珠海润都制药有限公司);小鼠S－180腹水瘤株(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院);PV二步法检测试剂盒及p53、Bcl－2单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);环磷酰胺(CTX，上海华联制药有限公司)。

2 实验方法

2.1 昆明种小鼠S－180肉瘤肿瘤模型的建立

抽取小鼠S－180腹水用生理盐水1∶2稀释，取昆明种小鼠30只，以0.1ml/只接种右侧腋下制备局灶性实体瘤模型。

2.2 凋亡调控基因p53、Bcl－2表达的检测

取接种S－180肿瘤细胞的小鼠随机分为3组:模型组，CTX组，OA组。于接种S－180肿瘤细胞6h后首次给药，OA组每天按2.496mg/kg体重灌服给药1次，CTX组按40mg/kg体重腹腔注射1次，模型组每天用生理盐水0.2ml/只灌服1次，连续给药8天。处死小鼠剥离肿瘤组织，采用PV二步法免疫组化法常规制片，检测凋亡调控基因p53、Bcl－2表达的情况。利用Motic Images Advanced 3.2分析软件对各组肿瘤组织中凋亡调控基因表达产物突变型p53蛋白阳性细胞平均光密度值和Bcl－2蛋白阳性细胞平均光密度值进行分析。

2.3 统计学方法

表1 齐墩果酸对S－180荷瘤小鼠肿瘤组织中突变型p53蛋白和Bcl－2蛋白表达的影响(±s)

表1 齐墩果酸对S－180荷瘤小鼠肿瘤组织中突变型p53蛋白和Bcl－2蛋白表达的影响(±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05。

组别给药量(mg/kg)n 平均光密度值(±s)p53蛋白 Bcl－2蛋白模型组 － 10 0.261 4 ±0.016 7 0.248 8 ±0.009 5 CTX 组 40 10 0.214 0 ±0.010 6* 0.203 4 ±0.005 6*OA 组 2.496 10 0.241 2 ±0.018 5* 0.232 2 ±0.011 6*

3 结果

齐墩果酸对S－180荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡调控基因p53、Bcl－2表达的影响，经免疫组化方法染色后，观察p53蛋白和Bcl－2蛋白表达在细胞核呈现棕黄色或棕褐色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在10×40高倍镜下，每张标本随机选取5个视野，精确选取视野内所有的阳性颗粒，对S－180荷瘤小鼠肿瘤组织中各组突变型p53蛋白和Bcl－2蛋白阳性细胞平均光密度值进行分析。结果见表1，与模型组比较，齐墩果酸组突变型p53蛋白和Bcl－2蛋白平均光密度值均明显降低(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。

4 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤的分子机制之一，许多人类恶性肿瘤的发展是其细胞的死亡过程严重受阻，而使肿瘤细胞在数量上无限制恶性增殖的结果。p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，p53基因抗肿瘤的机制之一就是触发肿瘤细胞凋亡。p53基因分野生型和突变型两种类型。野生型p53基因通过下调Bcl－2蛋白，上调Bax蛋白而诱导细胞凋亡;p53基因与其它调节细胞凋亡的基因或因子也相互作用和相互影响。而突变型p53基因则对细胞凋亡有抑制作用，p53基因突变后变为癌基因，并且表达增强，突变型p53蛋白半衰期延长，在组织和细胞中能检测到升高，故一般认为免疫组化检测到的是突变的p53基因表达产物，突变型p53基因具有致癌作用，其表达产物在人类大多数肿瘤中都过量表达。突变型p53蛋白表达增高与DNA修复能力的下降呈正相关性。Bcl－2基因是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，可抑制细胞凋亡。Bcl－2通过阻断程序性细胞死亡信号传递系统的最后的共同通道而抑制细胞凋亡，从而促进细胞的存活，因而它是一种重要的细胞生存基因。Bcl－2蛋白和突变型p53蛋白的过度表达可引起肿瘤等许多疾病，使之成为治疗这些疾病的药物作用的重要靶位。在恶性肿瘤细胞中，突变型p53蛋白和Bcl－2蛋白过度表达［2－5］。实验结果提示，齐墩果酸能下调S－180荷瘤小鼠肿瘤细胞内Bcl－2蛋白和突变型p53蛋白的表达，从而实现诱导肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤的作用，其机制还有待于进一步的研究。

［1］ 王奇，芦柏震.齐墩果酸的研究进展［J］.中国药房，2008，19(9):711－712.

［2］ 宋旭红.阿魏蘑菇提取物对肿瘤细胞p53表达的影响［J］.中国公共卫生，2003，19(6):690 －691.

［3］ 应小平，史迎丽，郭兰生，等.山仙颗粒对小鼠S－180肉瘤的抑瘤作用及bcl－2基因表达影响的实验研究［J］.陕西中医，2006，27(12):1588－1590.

［4］ 周忠光，白云，赵鑫，等.蝙蝠葛酚性碱对BxPC－3荷瘤裸鼠细胞凋亡相关基因P53蛋白表达的影响［J］.中医药学报，2011，39(2):31－33.

［5］ 尹丽颖，边晓燕，肖洪彬，等.辽东楤木叶总皂苷对H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表达的影响［J］.中医药学报，2010，38(1):18－20.