陈海亭， 尹蓉莉， 陈金玉， 王宝才， 党万太， 吕懿平

(成都中医药大学，四川成都611137)

山楂叶总黄酮(又称益心酮)，是从山楂叶中提取的黄酮类化合物的总称，对心血管疾病有明显的确切疗效［1-3］。目前已有山楂叶总黄酮的中成药制剂(益心酮系列产品)上市，有益心酮糖衣片、分散片、口服液、软胶囊、滴丸、注射液、泡腾片、冻干速溶片等［4］，但其有效成分溶解度小而影响吸收使大多数山楂叶总黄酮普通制剂生物利用度低［5］。本实验采用增加溶解度调节剂的方法［6-8］，改善山楂叶总黄酮的溶解度，从而将其制成微孔渗透泵控释片，提高其生物利用度，减少每天服用次数，而达到作用持久，增加患者顺应性的目的。同时为难溶性中药有效组分渗透泵控释给药系统的研究提供一定的参考依据。

星点设计(central composite designs，CCD)又称中心组合设计，是一种多因素多水平优化设计，可用三维效应面进行数据处理及非线性方程拟合，模拟方程可较好的预测结果［9］。国内常采用正交和均匀设计，但两者均基于线性模型，只能表明某一因素的取值方向而无法求得极值，所以预测的结果不够精确［10］。本实验采用星点设计结合效应面分析法优化山楂叶总黄酮微孔渗透泵控释片的处方。

1 材料和仪器

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100080-200707);山楂叶总黄酮提取物(规格:总黄酮质量分数≥80%，UV法;购于西安天园生物制剂厂);二醋酸纤维素(国家集团化学试剂有限公司);乳糖(成都市科龙化工试剂厂);丙酮(成都市科龙化工试剂厂);异丙醇(成都市科龙化工试剂厂);邻苯二甲酸二乙酯(DBP，成都市科龙化工试剂厂);PEG-400(成都市科龙化工试剂厂);PVP-K30(成都市科龙化工试剂厂);滑石粉(药用)，其它试剂为分析纯。

TDP-I型单冲压片机 (上海中药机械厂);BY-300A型小型包衣机(上海黄海药检仪器厂);UV-1100型紫外分光光度计;ZRS-8G智能溶试验仪(天津天大天发科技有限公司);BP211D-型电子分析天平(德国Sartorius);BF-200S-WEI型电子天平(德国Sartorius);BUG25-12型超声波清洗器(必能信超声上海有限公司);DGG-9240电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。

2 方法与结果

2．1 山楂叶总黄酮微孔渗透泵控释片的制备 将山楂叶总黄酮与辅料分别过80目筛。取处方量的山楂叶总黄酮与辅料按等量递增法混合均匀，然后加入5%的PVP乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，40℃烘箱中干燥2 h，然后2号筛整粒，加入适量的滑石粉混匀压片，即得片芯。

适量的二醋酸纤维素加入丙酮-异丙醇(100∶3)的混合溶液中，在超声条件下至完全溶解，然后加入适量的致孔剂PEG-400和增塑剂DBP。将片芯放入包衣锅内，喷雾速度保持在4．5 mL/min，包衣温度40℃，包衣锅转速为30 r/min，至包衣膜增重达到要求即可。

2．2 标准曲线的绘制 精密称取120℃减压干燥至恒质量的芦丁对照品10．25 mg，置50 mL的量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，既得0．205 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，使混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(附录V A)，于500 nm的波长处测定吸光度，以质量浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程 Y=0．012 1X －0．004 2(r=0．999 6)说明质量浓度与吸光度之间线性关系良好，线性范围为8．2 ～49．2 μg/mL。

2．3 释放度测定方法 取本品，按照《中国药典》(2010年版二部附录XC)释放度测定法第二法:桨法，以500 mL经脱气处理的蒸馏水为溶出介质，转速为100 r/min，溶出介质的温度为(37±0．5)℃。依法操作，在 2、4、6、8、10、12 h 分别取溶液 5 mL，0．45μm微孔滤膜过滤，并及时向溶出杯中补充介质5 mL。取续滤液稀释适当倍数后同2．2项显色，以相应的试剂为空白，在500 nm的波长处测定吸光度，带入标准曲线计算不同时间山楂叶总黄酮的累积释放度。

2．4 星点试验设计 预实验表明乳糖用量、致孔剂PEG400用量、包衣增重率是影响山楂叶总黄酮渗透泵控释片释放的主要因素。因此选择乳糖用量(X1)，致孔剂用量(X2)，包衣增重率(X3)为考察因素，以山楂叶总黄酮渗透泵控释片在2、6、12 h的累积释放度Y2、Y6、Y12为评价指标做三因素五水平的星点设计。根据星点设计原理，各因素取5个水平，用代码－α、－1、0、+1、+α来表示。对于三因素星点设计α=1．732，在预实验基础上设定X1范围:120～240 mg/片;X2范围:60% ～120%;X3范围:3%～6%。因素和水平代码以及实验安排结果见表1和表2。

表1 星点设计的因素和水平代码Tab．1 Variables and codes of composite design

2．5 模型拟合 用 Design-expert7．1．6统计软件，以各时间点累积释放度为评价指标分别对各考察因素进行多元线性回归和二项式方程拟合。

多元线性回归方程:

表2 星点实验安排及实验结果Tab．2 Factor and response of control com posite design

二项式拟合方程:

从以上拟合方程的相关系数可知，多元线性回归方程的相关系数明显低于二项式拟合方程的相关系数。可见多元线性回归拟合度不佳，预测性较差，因此选择二项式模型为最佳拟合模型。

2．6 效应面优化和预测 三维效应图只能表达两个因素和指标的函数关系，所以固定其中一个因素，设为中间值，对各评价指标做三维效应图和等高线(观察各组因素的三维效应图和等高线可知X3对Y12的影响显著。)由图1和图2可知，为满足药物释放要求使Y12＞90%，X3取值为3．7，将其代人上述拟合较优的二项式方程，采用Design-expert7．1．6软件绘制X1、X2对各指标的三维效应图和二维等高线图。见图3～5。

图1 X1和X3对Y12影响的三维效应图及等高线Fig．1 Response surface and contour p lot of Y12 as a function of X1 and X2

图2 X2和X3对Y12影响的三维效应图及等高线Fig．2 Response surface and contour plot of Y12 as a function of X2 and X3

图3 Y2的三维效应图及等高线图Fig．3 Response surface and contour p lot of Y2

图4 Y6的三维效应图及等高线图Fig．4 Response surface and contour p lot of Y5

图5 Y12的三维效应图及等高线图Fig．5 Response surface and contour plot of Y12

根据渗透泵控释制剂零级释放的特性，设定山楂叶总黄酮渗透泵控释片各时间点累积释放度的区域，Y2范围:20% ～30%;Y6范围:60% ～70%;Y12范围:＞90%。然后按此要求重叠各指标的二维等高线图，得到能同时满足以上条件的最佳区域。重叠等高线图见图6，图中重叠的白色区域即为处方的最佳区域。

图6 处方优化的重叠等高线图Fig．6 Over lay contour p lot of the optim ixed formu lation

由图3～5可看出三维效应图均为曲面，说明乳糖用量(X1)和致孔剂用量(X2)和各时间点的累积释放度存在非线性关系。图1表明随着乳糖用量(X1)的增大，Y2逐渐减小;随着孔剂用量(X2)的增大，Y2先逐渐减小，后逐渐增大;图2说明随着致孔剂用量(X2)的增大，Y4逐渐增大;图3说明随乳糖用量(X1)的增大，Y12先增加后减小;随着致孔剂用量(X2)的增大，Y12逐渐增大。以上说明乳糖用量(X1)和致孔剂用量(X2)对不同时间的药物释放的影响不同。

2．7 优化处方的验证 在上述最佳区域内选取3个点作为验证处方进行压片、包衣和释放度测定。验证处方评价指标实际值和预测值见表3，可知评价指标的实际值和预测值相对偏差绝对值均小于5%，说明实验所得拟合方程可以很好的预测各因素和评价指标之间的关系。释放曲线见图7，可见3个验证处方释药曲线的 R2值分别为0．982 6、0．980 1、0．984 2，说明零级释放特性良好。

表3 优化处方评价指标的预测值和实测值

图7 验证处方的释药曲线

3 讨论

目前国内在药剂处方的优化时多采用正交设计和均匀设计，且两者都是是基于线性模型的设计［11］。通常各因素对效应的影响并非呈线性关，所以正交设计和均匀设计的精度不高，建立的数学模型的预测性差［10］。星点设计和效应面优化法是近几年来国外药学工作者常用的实验设计和优化法，使用方便，优选条件预测性好［12］，且可用于非线性模型的设计。因此本实验采用星点设计结合效应面法，通过线性和非线性拟合得到最佳拟合方程，绘制三维效应面图和等高线图，采用重叠等高线图法［13］，得到最佳处方范围。

为了得到较好的优化结果，在进行响应面优化法之前，应保证设计的实验点应包括最佳的实验条件，如果实验点的选取不当，使用响应面优化法则不能得到很好的优化结果的。所以在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验因素与水平［12］。所以本实验首先采用单因素考察筛选出影响药物的释放主要因素及其水平范围，以保证得到较佳的优化结果。

最佳处方范围的3个处方评价指标的实际值和预测值的相对偏差的绝对值较小，零级释放特性明显，说明实验所得到的拟合方程可以较好地预测各因素与评价指标指标的关系。因此本实验采用星点设计-效应面法优化山楂叶总黄酮渗透泵控释片处方，所得处方符合要求，说明本方法可行。

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