刘宝华 谷 玥 姜晓明 李海峰 (吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

近年发现吉西他滨(Gemcitabine)是一种高效低毒的抗代谢类抗肿瘤新药，目前已广泛应用于肺癌和胰腺癌〔1，2〕，但对肝癌细胞的作用效果尚不明确。本研究以人肝癌细胞株(SMMC7721)细胞为靶细胞，观察吉西他滨在体外对人肝癌细胞凋亡和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与试剂 SMMC7721细胞(吉林大学基础医学院提供)，DMEM/F12培养基(GIBCO公司)，小牛血清(Hyclone公司)，二甲基亚砜(DMSO)，四唑氮蓝盐(MTT)(Sigma公司)。γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)和碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(上海长征医学科学有限公司)。甲胎蛋白(AFP)、血清清蛋白(ALB)放免测定盒(中国原子能科学研究院)。

1.1.2 仪器 Sanyo超净工作台，Olympus倒置显微镜，EM2000透射电镜，流式细胞仪Epics XLⅡ型。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人SMMC7721细胞常规培养于含10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L链霉素的DMEM/F12培养液中，在37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2.2 细胞凋亡率测定 取对数生长期细胞，制成1×105/L的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl，培养过夜。不同浓度吉西他滨对肝癌细胞凋亡的影响:空白对照组、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 吉西他滨处理组分别作用48 h后，制备各细胞悬液，加入固定破膜剂和碘化丙啶(PI)染液，室温避光反应30 min后上机检测，每个标本检测104个细胞，重复计数3次，流式细胞计数测定凋亡率。吉西他滨不同作用时间对肝癌细胞凋亡的影响:10 mg/L吉西他滨作用于肝癌细胞 24、48、72、96、120 h，进行 PI染色，流式细胞计数测定凋亡率。

1.2.3 γ-GT和ALP活性测定 细胞用0.25%胰酶消化，2 000 r/min离心10 min后，加入预冷的0.25%脱氧胆酸钠溶解细胞，然后4℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清液，－70℃保存备用。按酶促反应试剂盒说明测定γ-GT和 ALP活性，总蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。γ-GT或ALP比活力(IU/g)计算公式γ-GT或ALP值 /总蛋白量。

1.2.4 AFP和ALB分泌量测定 收集经10 mg/L吉西他滨作用48 h及相应对照组的细胞培养液，4 000 r/min离心5 min，取上清冷冻干燥。细胞消化后染色计数活细胞数。将干燥后的培养液溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，按放免试剂盒说明进行检测，测定AFP和ALB的含量。

1.3 统计学分析 采用t、χ2检验。

2 结果

2.1 吉西他滨对SMMC7721肝癌细胞凋亡的影响

2.1.1 不同浓度吉西他滨对肝癌细胞凋亡的影响 1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L 吉西他滨作用肝癌细胞 48 h 后，凋亡百分率分别为 3.25% ±0.62%、4.68% ±0.73%、9.63% ±1.56%、18.84% ±4.26%、23.56% ±4.64%、25.85±4.67%，对照组为2.28% ±0.55%，提示对肝癌细胞的凋亡率随着吉西他滨浓度的增大而升高，其中10 mg/L以上组与对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。

2.1.2 吉西他滨(10 mg/L)不同作用时间对肝癌细胞凋亡的影响 随作用时间的延长，凋亡率逐渐升高，24、48、72、96、120 h，凋亡率分别为 4.37% ±0.76%、18.34% ±1.47%、26.49% ±2.43%、30.26% ±2.45%、33.58% ±2.65%，在72 h肝癌细胞凋亡率与24 h相比明显增大(P＜0.01)。而120 h与72 h相比无统计学差异(P＞0.05)。提示吉西他滨促进肝癌细胞凋亡的效果在72 h时最为明显。

2.2 吉西他滨对肝癌细胞γ-GT活性、ALP活性及AFP、ALB分泌的影响 吉西他滨组培养48 h后γ-GT比活力及ALP比活力明显低于对照组(P＜0.05)，AFP分泌量较对照组细胞显著降低，ALB分泌显著升高，与对照组比较均有显著差异(P＜0.01)。见表1。

表1 吉西他滨对肝癌细胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影响(±s)

表1 吉西他滨对肝癌细胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影响(±s)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别γ-GT(IU/g)ALP(IU/g)ALB(g/L)AFP(μg/L)对照组 14.59±0.89 352.28±27.37 50.49±4.09 78.54±6.88吉西他滨组 10.52±0.6131)317.58±21.1931)85.59±7.6932)42.65±4.2732)

3 讨论

吉西他滨是细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞，在一定条件下可以阻止G1期向 S 期的进展〔3，4〕。

本研究中细胞凋亡实验结果显示，10～40 mg/L吉西他滨能显著促进肝癌细胞的凋亡，10 mg/L作用凋亡百分率可达18.84%±4.26%，并且吉西他滨对肝癌细胞的凋亡作用具有随时间和剂量升高而增强的效果。可见吉西他滨可以直接作用于肝癌细胞，抑制细胞的生长，促进肝癌细胞凋亡。

为了探讨肝癌细胞分化的定量指标，本实验根据肝细胞的代谢特点，选择了几种反映肝细胞分化的特异性酶和蛋白为标志。γ-GT在正常鼠肝中的活性极低，而在肝癌时，由于癌细胞逆分化，类似胚胎期，此酶的生成增加，故血清γ-GT也呈中度或高度升高，临床上也常把此酶作为观察慢性肝炎伴肝硬化病人是否进展为肝癌的参考指标。ALP广泛分布于人体的骨、肝、肠、胎盘等组织中，正常人血清中ALP主要来自骨和肝，约各占总活性一半。肝内占位性病变，如原发性肝癌、继发性肝癌时，由于癌细胞可合成ALP，以致血中ALP中度甚至明显升高。ALB是肝细胞分化成熟的指标。AFP则是公认的肝细胞增殖和恶变的重要标志物。本研究发现吉西他滨可抑制肝癌细胞合成、分泌γ-GT、ALP及AFP，并可相应增加 ALB分泌量。提示吉西他滨具有诱导肝癌细胞向良性细胞分化的作用，对其在临床上的应用有指导价值。

1 Cesario A，Margaritora S，Trodella L，et al.Incidental surgical findings of a phaseⅠtrial of weekly gemcitabine and concurrent radiotherapy in patients with unresectable non-small cell lung cancer J〔J〕.Lung Cancer，2002;37(2):207-12.

2 Schiller J H，Harrington D，Belani CP，et al.Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med，2002;346(2):92-8.

3 Hamada S，Satoh K.MSX2 overexpression inhibits gemcitabine-induced caspase-3 activity in pancreatic cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(43):6867-70.

4 Rosell R，Felip E，Taron M，et al.Gene expression as a predictive marker of outcome in stage ⅡB-ⅢA-ⅢB non-small cell lung cancer after induction gemcitabine-based chemotherapy followed by resectional surgery〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(12):4215-9.