郝 鹏,王 红,解广勤,胡建宏＊,杨海涛,贾永宏

(1.陕西省家畜改良站,陕西泾阳 713702;2.西北农林科技大学动物科技学院 ,陕西 杨凌 712100; 3.武警陕西省总队后勤部农副业基地,陕西西安 712200)

早在20世纪50年代左右,英国、丹麦、美国、日本等畜牧业发达国家普遍推行牛的人工授精技术。我国牛的人工授精技术于20世纪70年代在生产中得到普及推广,对促进我国养牛业的发展发挥了重大作用。牛精液的冷冻保存在家畜冷冻精液研究中最为成功,尤其是目前所有的奶牛场均利用冷冻精液,通过人工授精技术繁育后代。虽然如此,我国牛冷冻精液的研究水平与国外同类研究相比比较落后,精子活率低于国外标准。本文就牛冷冻精液的发展历程以及牛精液冷冻保护剂和评定指标等进行综述,以期对牛冷冻精液的研究有所借鉴,进一步提高牛冷冻精液的质量。

1 牛冷冻精液的发展历程

家畜精液冷冻保存最早可追溯到1776年,意大利人Spallanzanei首先发现自然界中的低温物质(冰雪)可对人精子的活动状态产生影响。1949年,科学家发现了甘油对鸡精液的冷冻保护作用,促使精液的冷冻保存技术取得了较大进展。随后Polge和Smith等[1]对牛羊精液进行了试验,发现稀释液中加入15%～20%的甘油,并以10℃/min的降温速度由0℃缓慢降至-79℃时,精子存活率会有很大提高。

1950年,美国用经冷冻过的良种公牛精液给38头母牛输精,怀孕率为79%,并首次获得来自冷冻精液的犊牛,这是家畜中最早利用冷冻精液进行人工授精获得成功的报道。虽然后来人们又做了大量的输精试验,但受胎率很低。为了提高冷冻精液输精时母牛的受胎率,Polge和Rowso等[2]通过改变精液的处理程序,极大地提高了精子的存活率和受胎率。冷冻—解冻后精子的复苏率可达70%～80%,并用-79℃冷冻保存2 h至8 d后的精液给38头母牛输精,其中30头受胎。Polge[3]以冷冻保存1～5周的精液输精208头母牛,平均受胎率达65%。从此以后,许多科学家就稀释液配方、稀释倍数和稀释方法、甘油浓度、精液平衡温度和时间、降温速度以及解冻方法等精液冷冻的各个步骤进行了大量研究,致使冷冻精液的应用取得快速发展。精液的超低温冷冻保存技术越来越受到各国的重视,许多国家相继建立了牛、猪、羊及人类的精子库。

2 牛精液冷冻保存的基本原理

精子具有受温度变化直接影响其本身活动力和代谢能力的生物学特性[4]。精子保存在超低温状态下,其代谢活动完全受到抑制,生命以相对静止状态保持下来,一旦升温又能复苏而不失去受精能力。精子之所以能够复苏的关键在于精液在冷冻过程中,在冷冻剂的保护下,防止了精子水分冰晶化对精子的破坏,而尽可能形成玻璃化。

冰晶化是水在降温过程中的一定温度条件下,水分子重新按照几何图形排列形成冰晶的过程。冰晶改变了精子膜的溶质浓度和渗透压,造成精子脱水,发生不可逆的化学毒害而死亡。冰晶化只有当温度在0～-60℃温度范围内缓慢降温时形成,降温越慢冰晶越大,-15～-25℃形成冰晶最多。玻璃化的冰冻状态是水在超低温下,水分子仍然保持原来自然的一种无次序的排列状态,形成玻璃样的坚硬而均匀的冰结[5]。在此状态下,精子不会发生细胞脱水,结构维持正常。为避免冷冻过程中精子发生冰晶化,必须尽快通过危险温区,形成玻璃化冻结。该过程具有不稳定的可逆性,精液冷冻的降温和升温均应快速处理。

3 牛冷冻精液的冷冻保护剂

甘油作为稀释液中常用的冷冻保护剂,一方面对精子有保护作用,另一方面又对精子具有损伤作用,因而新型抗冻剂的开发一直备受关注。昝林森等[6]研究证明,海藻糖和牛血清白蛋白单独和配伍使用都能对冻后精子品质产生明显影响;胡传活等[7]探索了乳铁蛋白在牛精液冷冻中的效果,发现乳铁蛋白对精子冻后活力、运动性能、畸形率、顶体完整率及质膜完整性均没有显著影响。冷冻稀释液充当精子载体的作用,包含很多能够调节精子受精能力的因子,并为精子提供代谢物质的功能。因此,对精子稀释液的组成物质以及精子与环境物质的作用关系,有必要进行更多研究。

由于使用动物冷冻保护剂可能导致疾病的传播与病菌的感染,近年来科学家一直在探索使用植物冷冻保护剂。Moussa等[8]报道,以蛋黄中提取的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黄冷冻牛精液,其效果比商业用的稀释液好。Bucak等[9]研究了蛋氨酸、肌醇和肉碱对冻融后牛精子各种参数(活力、异常率、DNA的完整性和受胎率)和氧化应激指标(脂质过氧化、谷胱甘肽和总抗氧化能力水平)的作用。结果表明,在冷冻前添加抗氧化剂可以维持精子DNA的完整性,使其免受冷冻损伤。Tuncer等[10]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽对冻融后牛精子氧化应激指标的影响。结果表明,半胱氨酸和谷胱甘肽对精子形态并没有显著的影响,但可以降低冷冻过程对精子DNA的损害。Ansari等[11]研究证明,在稀释液中添加丁羟甲苯可以显著提高牛精液活力、质膜完整性和生存能力。

Hu等[12,13]发现,牛冷冻精液稀释液中添加维生素B12可以显著提高精子活力、顶体完整率和质膜完整率,而添加LDL显著增加线粒体活性、顶体完整、膜的完整性以及DNA完整性。为了提高精子的抗氧化能力,Hu等[14,15]在牛冷冻稀释液中添加维生素,发现可以有效减少由冷冻-解冻造成的氧化应激,从而提高牛精子的冻后品质。同时表明,抗氧化体系中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)对维持牛精子的活力和运动能力发挥重要作用。Hu等[16]检测了海藻糖对牛精液质量和冻融后抗氧化活性的影响。结果证明,稀释液中添加海藻糖可以降低由冻融引起的氧化应激,从而提高冷冻-解冻后的牛精液品质。

4 牛冷冻精液的质量检测

目前已经有很多种方法检测精子的质量,诸如精子活力、精子形态、精子存活时间等[4]。常规精液检测主要包括精子形态、精子浓度和精子活力三个部分。计算机辅助精液分析(CASA)系统是近些年推出的利用计算机辅助精子运动图像分析仪来检测精子质量的技术。该系统操作简单、客观、快速、重复性好、准确性高,能分析与精子运动功能相关的多种参数。流式细胞仪是检测精子质量的一种新的方法,与传统的光学检测或荧光显微镜染色技术相比,流式细胞仪检测冷冻-解冻后精子的质量具有高通量、准确和简便等特点。检测指标比较全面,能够充分反应精子的结构和功能状态。当然,预测精子受精能力的最好评估手段是IVF试验,即在体外条件下让解冻后精子按一定的比例与卵母细胞共同孵育,检查其第一极体排出率、2～4细胞发育率、囊胚和扩张囊胚发育率等指标,并建立这些指标与母牛不返情率之间的相关性。在评定冻后精子的受精能力时,通过这些指标的测定,对于预测使用冷冻精液人工授精后母牛的不返情率、受胎率等具有重要意义。精子各项质量指标之间具有很强的相关性,利用其相关性客观准确的综合评定冻后精子质量,可为牛冷冻精液的应用提供一定的依据。

虽然牛冷冻精液的研究相对比较成功,应用也比较广泛,但一般的研究仅仅涉及不同稀释液对精液冷冻质量的影响,来探求最好的冷冻稀释液配方。关于稀释液中不同成分提高精子活力的机理,影响精子冻后活力的基因与蛋白及其相互作用和表达的信号途径等,相对研究较少,从而对其作用机理不甚清楚。特别是我国牛冷冻精液的研究水平与国外相比仍然存在较大差距,例如目前国内生产的细管冻精解冻后精子活率仅达到30%左右,远远低于国外活率达到50%的生产标准。因此,我们要进一步加大研究力度,建立精子低损伤冷冻技术,切实提高牛冷冻精液的质量水平。牛精液冷冻技术与人工授精、体外授精、性别控制等现代生物技术的有机结合,在新世纪必将对我国地方低产品种改良、保护优良种质资源以及大力发展畜牧业、提高人们的生活水平、拉动区域经济腾飞等发挥巨大作用,具有广阔的应用前景。

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