黎仁军,苗永旺

(云南农业大学动物科学与技术学院,云南昆明 650201)

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8(grow th differentiation factor 8,生长分化因子8),属 TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子β)超家族,是在骨骼肌中广泛表达的一种糖蛋白,其生物学功能变化会通过调节靶基因的表达,改变肌肉的纤维组成并造成肌肉重量的变化。肌肉生长抑制素基因是由美国John Hopkins大学医学院Mepherron和Lee等的研究小组在研究转化生长因子β家族时发现的一种生长分化因子[1]。Kambadur发现双肌牛中MSTN基因发生突变,结果在同样喂食条件下,双肌牛比普通牛多提供30%的肉产品[2]。由于GDF-8对骨骼肌的生长具有负调控作用,所以又命名为肌生成抑制素。该因子在生物医学和畜牧业等具有很大的潜在应用价值,所以一经发现就受到科学工作者的广泛重视,现而今已成为分子生物学领域的一个研究热点。

1 MSTN基因的发现

早在十九世纪人们就发现了具有双肌性状的牛,由于这种牛具有瘦肉率高、屠宰率高等特点,因此人们对双肌性状的起因、结构特点、遗传机制等进行了相关的研究。直到1997年,McPherron等通过筛选小鼠的骨骼肌cDNA文库而得到全长的cDNA序列,分析得出小鼠MSTN基因cDNA序列中只有一个开放阅读框架(opening reading frame,ORF),编码376个氨基酸,具有TGF-β超家族的典型结构,但与其它 TGF-β家族成员的同源性很低(最高为45%),因而被归为新一类命名为GDF-8[1,3,4]。利用基因敲除技术使小鼠的GDF-8的C-端生物活性区缺失,得到的缺失纯合体小鼠可以存活并能够生育,其体重要比杂合型和野生型小鼠重约30%,单块肌肉的重量为野生型小鼠的2～3倍[5]。因此根据该基因具有抑制肌肉发育的功能和表达的组织特异性,将其命名为肌肉生长抑制素基因[6]。

2 MSTN基因的结构特点

MSTN基因编码的蛋白质是TGF-β的一员,它具有TGF-β超家族的典型结构特点:其氨基酸序列有家族特征,在MSTN蛋白的N-末端有相同的非亲水性氨基酸序列作为分泌信号;一般有9个半胱氨酸位于C-末端形成“半胱氨酸节点”;其C-末端通过形成二硫键组成具有生物学活性的二聚体发挥其功能且C-末端都有保守的由四个氨基酸Arg-Ser-Arg-Arg(RSRR,第263～266位)组成的蛋白酶加工位点[7]。

迄今为止,已经通过染色体遗传和物理图像分析对牛的MSTN基因进行了染色体定位,该基因位于:牛2q11[8,9]。牛MSTN基因第1和第2外显子的长度分别为506 bp和374 bp,第3外显子的长度由于poly(A)尾巴位点的不同而有所差异,分别为1 701,1 812或1 887个核苷酸,两个内含子的长度分别为1 840 bp和2 033 bp[10]。Marcq等分析了比利时Texel(特塞尔绵羊)双肌绵羊的遗传机制,其MSTN基因的编码区与普通绵羊没有碱基差异。采用该基因侧翼的微卫星标记进行连锁分析表明,在绵羊染色体2远端区存在1个对肌肉的发育产生效应的 QT L(quantitative trait loci,数量性状位点),该座位很可能就是MSTN基因。刘铮铸[5]利用PCR方法扩增得到了山羊的MSTN基因5 211 bp的DNA序列,包括了该基因的完整编码区。有3个外显子和2个内含子,外显子的大小分别为:373 bp、374 bp 、381 bp;内含子分别 为 1 834 bp 、2 027 bp。

3 MSTN基因的作用机制

在哺乳动物中,MSTN主要在骨骼肌中表达,并且在生长时期和成熟期的骨骼肌中均有表达。和其他TGF-β成员一样,MSTN基因也是先合成前体蛋白,经二次蛋白酶酶解活化,将MSTN基因表达产物分泌到胞外,之后形成的前肽在RSRR区被切除N端约266个氨基酸,剩成熟区109个氨基酸以二硫键的方式结合成二聚体,再和膜上的特异性受体发生作用,通过三种Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)介导,将信号传到细胞核,最后调节靶基因的表达从而对骨骼肌纤维数量和粗细进行调节。

为了验证MSTN具有抑制肌细胞生长的作用,Taylor[11]等在2001年研究检测了重组MSTN基因对鼠骨骼肌细胞的影响,结果发现重组MSTN基因编码的蛋白可抑制细胞的增生、DNA的合成以及蛋白质的合成,从而抑制肌肉的生长。2002年Langley[12]等探讨了MSTN基因抑制成肌细胞分化,并阐述了这种抑制作用是通过Smad3介导的。体外实验向低血清浓度培养的成肌细胞中增加MSTN融合蛋白可以可逆的阻断成肌细胞的分化。分析表明MSTN可以使MyoD(Myogenic Differentiation Antigen,成肌分化抗原),Myf5(Myogenic regulatory factor 5,成肌调节因子5)和Myogenin(肌细胞生成素)等肌肉调节因子水平下降,从而抑制成肌细胞的分化。

4 MSTN基因的研究进展

4.1 MSTN基因的表达研究

MSTN基因在动物的不同发育时期和不同物种间的表达不同,在哺乳动物中,MSTN在胚胎发育时期和成年个体骨骼肌中均有表达。在牛胚胎中,从第15 d到第29 d都能检测到少量MSTN基因的mRNA,但是第31 d后mRNA的量会逐渐增加。Ferec[14]等运用定量RT-PCR技术分析了初生牛中该基因的表达,在股二头肌和半肌腱中该基因在出生后1 d表达水平最高,第8 d和第14 d后慢慢降低。而在排肠肌中该基因在出生后第14 d表达水平最高,第8 d后最低。除了在骨骼肌中有表达外还发现其他组织中也有MSTN基因的表达,只是含量较低。Sharma[13]等发现在牛和绵羊的心肌组织中检测到MSTN蛋白。在脂肪组织发现也有表达,暗示其可抑制前成脂肪细胞(preadipocyte)分化[14]。Casas[15]等研究了从比利时兰牛与MARCⅢ(1/4Angus,1/4Hereford,1/4Red poll,1/4Pinzgauer)的杂交牛、皮埃蒙特(Piedmontese)与安格斯(Angus)的杂交牛这两个半同胞家系中分离出MSTN的纯化拷贝型与数量性状座位的互作效应,发现5号染色体与肌肉的剪切嫩度有关,14号染色体与脂肪厚度有关。郭丹[16]等采用PCR-SSCP方法对草原红牛(Grassland Red)和利木赞牛(Limousin)与草原红牛的杂交牛进行了单核苷酸多态性分析,发现282位碱基发生突变,由C突变为A,导致编码的氨基酸由苯丙氨酸变为亮氨酸,这与Grobet于1998年发现欧洲利木赞牛的MSTN基因第1外显子的突变相符。并且检验了不同性状在该点不同基因型间的显著性,结果表明等位基因B可以显著的提高草原红牛的日增重、屠宰率、净肉率和肉骨比。

4.2 MSTN基因的突变及多态性研究

以产肉多而闻名的比利时兰牛(Belgian blue)和皮埃蒙特牛中双肌表型发生频率最高,其中比利时兰牛该基因在第3外显子存在l1个碱基(937～947)的缺失,造成移码突变,使得从缺失后面的第14个密码子开始停止翻译,其结果是C-端仅7个氨基酸得到翻译,其余102个氨基酸(274～375)全部缺失,翻译出的是一个截断蛋白而失去抑制肌肉生长的作用。双肌表型的皮埃蒙特牛中MSTN基因也发生了2个突变,一个突变位点位(G※A)于第3外显子,结果导致保守的半胱氨酸(Cys)被酪氨酸(Tyr)所取代,使得肌肉生长抑制素的功能全部或几乎全部丧失。经Southern杂交分析表明,比利时兰牛和皮埃蒙特牛均为突变纯合子。另一个突变在第1外显子上(C※A),结果导致亮氨酸(Leu)变为苯丙氨酸(Phe)。分析表明,未在皮埃蒙特牛中检出突变,只在红安格斯牛(Red Angus)中发现1例比利时兰牛型突变的杂合子,说明该基因的突变是造成双肌的原因之一[2,17]。从功能上看,双肌牛中MSTN基因的突变导致该基因产物活性丧失,分子活性区域消失,结果肌肉大量增加,使饲料转化效率提高。不利的效应是母牛的生育能力下降,犊牛的成活率降低以及性成熟延迟,还会使牛肉的肌间脂肪及结缔组织减少,机体内部器官重量减轻等[18]。Bellinge[19]等在牛MSTN基因编码区共发现9种能产生非同义密码子的突变,其中3种为错义突变,包括外显子1中2种和外显子2中1种。另外6种突变位于外显子2和外显子3,导致提前形成终止密码子,致使蛋白失活,从而失去了对肌纤维生长发育的抑制作用。Grobet[20]等检测了10个欧洲牛品种的32头双肌牛,发现了7个DNA多态型,其中5个推测造成了蛋白质功能的改变,1个为保守氨基酸替换,另一个为沉默DNA突变,在内含子中检出了4个DNA多态型,除2个品种外,其它品种的双肌牛均为5个功能缺失突变体之一的复杂杂合子或是纯合子,缺少明显功能突变的其它2个品种推测在基因的未测片段有另外的突变或是双肌牛的位点异质性所致 。史明艳[21]等对南阳牛和秦川牛的MSTN基因全序列研究结果表明:45头南阳牛种只有第三外显子938位碱基处发生了G※A的突变,而30头秦川牛中没有突变。常春芳[22]等对4个品种66个样本MSTN基因外显子2序列分析结果表明:18个雷琼牛样本没有发生变异,多态性较贫乏,18头蒙古牛有1个变异位点,牦牛有2个变异位点,而12头独龙牛有1个位点发生变异。冀德君[23]等在18头蒙古牛样本中检测到1个核苷酸多态位点,含有两种核苷酸类型。在19头海子水牛样本中检测到3个核苷酸多态位点以及2种基因单型。Li[24]等测定了24个山羊品种、8个绵羊品种MSTN基因部分内含子2序列,发现7个多态位点,属于完全连锁平衡,能划分出3个单倍型。在绵羊品种中未发现多态性位点。Clop[25]等发现双肌羊 Texel是由于MSTN基因3'UTR(Untranslated Regions,非翻译区)发生了1个点突变,产生miR1和miR206两种骨骼肌表达的microRNAs,抑制MSTN基因的翻译,从而导致Texel肌肉肥大的性状。

4.3 MSTN基因的基因敲除研究

采用基因打靶技术人工剔除MSTN基因,获得转基因动物的研究已取得较大进展,如剔除MSTN基因的小鼠。目前以体细胞MSTN基因敲除生产转基因牛、羊的研究工作都正在进行中。2011年孙丹[26]等利用LA-PCR技术,对分子克隆连接技术进行优化,最大可能获取长片段基因序列作为同源臂,应用基因打靶技术体外构建针对绵羊MSTN基因第3外显子的基因打靶载体,使绵羊体内MSTN基因失活,以达到提高产肉量的目的。李湘萍[27]等对绵羊体细胞MSTN基因进行敲除实验,结果表明对绵羊成纤维细胞进行基因修饰是可行的。

5 MSTN基因的应用前景

MSTN基因是继生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGFs)之后新发现的功能基因,由于该基因是骨骼肌生长抑制因子,通过对该基因的研究,基因突变是引起双肌性状的重要原因之一已经很明确了,这就为增加动物机体产肉量提供了一种方式和途径,为动物育种学家提供了一种新思路。于是国内外学者试图通过基因敲除和转基因等方法达到增加肉产量和提高肉品质的目的,若能利用基因敲除技术能在牛或羊等重要肉容家畜上敲除MSTN基因而产生骨骼肌明显增大的品质,这将具有很高的经济价值。另外也可以在畜牧业上可以筛选MSTN基因突变的个体,通过育种培育出产肉率高的优良品种。此外,利用基因重组技术可以获得MSTN基因缺失的动物,或通过筛选MSTN基因的抗体或抑制剂,使之与MSTN基因结合,灭活其功能,从而进一步开发安全可靠的新型饲料添加剂,为生产放心肉提供新的途径。

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