徐小寅，严 杰，孙 琦

(1.浙江大学医学院病原生物学系，浙江杭州310058;2.浙江医学高等专科学校，浙江杭州310053)

抗生肽(antibiotic peptide)或称抗菌肽(antibacterial peptide)是许多生物体内基因编码、特定外界条件诱生的一类具有多种生物学活性的小分子多肽，具有对热稳定、有广谱杀菌或杀肿瘤细胞的作用，而且不易产生耐药性等特点［1-2］。Alloferon-1是 Chernysh等(2002 年)从一种丽蝇(Calliphora vicina)血液中分离的新型抗生肽，由13个氨基酸组成，相对分子量为1481.53［3］。研究表明，Alloferon-1 较其它抗菌肽有更为明确的抗病毒和抗肿瘤效果。然而，天然抗生肽表达量较低、提取步骤复杂、得率不高，而采用化学合成法合成的抗生肽价格昂贵［1，4］。因此，采用基因工程技术高效表达Alloferon-1有重要的现实意义［5］。

由于Alloferon-1序列中不含赖氨酸和精氨酸，而且C端序列对其活性无明显影响，本研究在Alloferon-1序列C端加入胰蛋白酶酶切位点的赖氨酸残基(Alloferon-1-K)，构建了重复14次的Alloferon-1-K串联DNA片段及其原核表达系统，建立了目的重组融合表达产物14×rAlloferon-1-K及其胰蛋白酶消化后rAlloferon-1-K单体提纯方法，并采用 CCK8法检测了rAlloferon-1-K体外抗肿瘤的生物学活性，以期为rAlloferon-1-K开发为抗肿瘤新型多肽类药物提供判断依据。

1 材料与方法

1.1 Alloferon-1和Alloferon-1-K合成 根据Alloferon-1序列［1］，委托上海 Invitrogen公司合成Alloferon-1(cAlloferon-1)及C端加有赖氨酸的Alloferon-1(cAlloferon-1-K)。cAlloferon-1序列:His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly。Alloferon-1-K序列:His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-Lys。

1.2 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K直接抗肿瘤试验 96孔细胞培养板每孔接种1×104人口腔鳞状上皮癌KB细胞、2×104人胃腺癌SGC细胞，采用10%胎牛血清 RPMI-1640培养液(GiBco)在5%CO2、37℃培养12 h。96 孔细胞培养板每孔接种悬于2.5%胎牛血清(FCS)RPMI-1640培养液中的1×105人白血病K562细胞。各细胞培养物中加入用2.5%FCS RPMI-1640培养液配制的不同浓度cAlloferon-1或cAlloferon-1-K药物……