朱 蕾，陈 智，陈建忠，王 静，胡中荣，陈离伟，刘荣华，胡敏君，朱海红

(1.浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室，浙江杭州310003;2.浙江大学免疫研究所，浙江杭州310058)

在我国，乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发病率、死亡率均排名于疾病谱前列，严重危害人民健康［1-3］。近来，许多研究表明宿主和某些病毒都可以编码微小 RNA(microRNA，miRNA)，在调控病毒生命周期及病毒与宿主相互作用的过程中起到非常关键的作用［4-7］。

人类miR-122是一种肝脏特异性表达的微小RNA，约占肝脏总miRNA的70%。它位于人第 18 号染色体上的，定位于 18q21.31［8］。近来研究表明，miR-122不仅与丙型肝炎的复制相关［10］，而且在肝细胞肝癌组织中以及所有的肝细胞肝癌衍生的细胞系中表达下调［9-10］。为了探索miR-122和HBV致病机制的关系，我们利用体外稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞模型，利用合成的miRNA和反义技术调控细胞miR-122水平，探索miR-122水平和HBV表达之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2.2.15细胞为本所常规传代保 存。LipofectamineTM2000、Opti-MEM I reduced serum medium、Trizol均购自美国Invitrogen公司。G418购自美国Hyclone公司。RNase Inhibitor、 MultiScribeTMReverse Transcriptase、dNTPs、10 × Reverse Transcription Buffer、Nuclease-free water、RT primer、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix、No AmpErase UNG均购自美国 Applied Biosystems公司。HBV DNA定量试剂盒购自杭州博康有限公司。

hsa-miR-122由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，锁核酸修饰的LNA-anti-miR122由美国Sigma公司合成，anti-miR-122由北京奥科生物技术有限责任公司合成，anti-GFP由北京奥科生物技术有限责任公司合成，其设计如下:

1.2 方法

1.2.1 瞬时转染HepG2.2.15细胞并分组培养 常规培养HepG2.2.15细胞于含10%胎牛血清、G418 600 μg/ml的 DMEM 完全培养液中。转染前1天将细胞以1×105∕孔细胞接种于12孔培养板，待细胞融合率达到80% ～90%，用优化培养基(Opti-MEM I reduced serum medium)清洗2次，按照 LipofectamineTM2000说明书进行转染。设:hsa-miR-122组、anti-GFP组、anti-miR122组和LNA anti-miR122组，其终浓度分别为 400 nmol/L、400 nmol/L、400 nmol/L和40 nmol/L。……