李苏娟，陈 智，朱海红

(浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(HCV)是导致肝脏疾病的一个重要病原体，约80%的HCV感染者会发展为慢性肝炎［1］。目前，IFN-α 联合利巴韦林(RBV)是治疗慢性丙型肝炎(CHC)的标准方案，但仅有约50%患者能获得持续病毒学应答(SVR)［2］，这与宿主、病毒和 IFN 等因素有关［3-4］。miR-122是一种肝脏特异性的miRNA，占肝脏总miRNA表达量的70%［5］，与肝脏的发育、代谢及癌症有关［6-7］。近年来，Jopling等［8］发现miR-122促进HCV的复制，系第一个被证明与病毒复制成正相关的宿主miRNA。本研究旨在探讨miR-122是否影响IFN-α的抗HCV效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和细胞 含有HCV全长基因组的质粒pFL-Jc1由美国Apath公司惠赠，Huh7.5.1细胞来自美国斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由中国科学院上海巴斯德研究所钟劲教授提供。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、FBS和Opti-MEM 购自Gibco公司，IFN-α购自PBL公司，Trizol和 LipofectamineTM2000 购自Invitrogen公司，限制性内切酶Xba、绿豆核酸酶、蛋白酶 K、DNA marker、逆转录试剂盒和SYBR Green Taq试剂盒均购自Takara公司，T7体外转录试剂盒(T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System)购自 Promega公司，RNeasy Mini Kits购自Qiagen公司。

1.1.3 引物 U6和miR-122的逆转录引物和上下游引物均购自广州锐博公司。GAPDH上游和下游引物分别为GAAGGTGAAGGTC GAGTC和GAAGATGGTGATGGGATTTC;HCV 5＇UTR上游和下游引物分别为GCGTTAGTAT GAGTGTCGTG 和 TCGCAAGCACCCTATCAG，均由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HCV pFL-JC1的线性化 取质粒44 μl，加入1 μl限制性内切酶 Xba 及5 μl相应缓冲液，37℃孵育2 h，使质粒线性化，取2 μl反应液以1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切消化完全。用酚氯仿法纯化DNA后，分别以绿豆核酸酶和蛋白酶K处理，再用酚氯仿法抽提纯化DNA，用12 μl水溶解 DNA，取1 μl跑电泳检测酶切消化后DNA片段的大小。

1.2.2 体外转录 以2 μg上述线性化的DNA为模板，用promega T7 RiboMAXTMRNA体外转录试剂盒对模板体外转录，反应体系为20 μl，37℃ 孵育 2 h。……