张雪霞，李 宁，李晓露，林 旸，张金娟，林 毅，蒋 沁

(微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050015)

天然产物纽莫康定(Pneumocandins)是一类新型环脂肽类抗真菌化合物，具有环状六肽母核和脂肪酸侧链结构[1]，将其中的纽莫康定A0和纽莫康定B0的脂肪酸侧链脱掉后的环状六肽母核分别是合成米卡芬净(Micafungin)和卡泊芬净(Caspofungin)的主要原料[2，3]。米卡芬净和卡泊芬净是一类全新的棘白菌素(Echinocandins)类抗真菌药，对大多数念珠菌(包括一些对唑类耐药的菌株)具有快速的杀灭作用、对大多数曲霉有抑制作用[4，5]。

纽莫康定的发酵液中含有纽莫康定A0与纽莫康定B0，同时测定纽莫康定A0与B0含量的方法尚未见报道。作者在此采用HPLC法同时测定发酵液中纽莫康定A0与B0的含量，对检测条件进行了考察，为同时测定发酵液中纽莫康定A0与B0的含量提供了一条有效途径。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

纽莫康定发酵液，华药集团新药公司。

纽莫康定A0对照品(含量95.72%)、纽莫康定B0对照品(含量96.14%)，自制；分析用甲醇，色谱纯，Merck公司；提取用甲醇，分析纯；去离子水，自制。

高效液相色谱仪(515泵，996检测器)，Waters公司。

1.2 对照品溶液的配制

精密称取纽莫康定A0对照品20.0 mg、B0对照品16.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，得混合对照品贮备液。精密量取贮备液5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，定容，摇匀，得混合对照品溶液。

1.3 供试品溶液的制备

量取50 mL纽莫康定发酵液，过滤，得菌丝滤饼，向菌丝滤饼中加入甲醇200 mL，超声提取30 min，过滤，重复提取2次，合并滤液，混合均匀，用0.22 μm的膜滤过，得供试品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱为SepaxSapphire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为室温；流动相为甲醇-水(体积比45∶55，内含0.1‰三氟乙酸)；流速1.0 mL·min-1；检测波长214 nm；进样量10 μL。

纽莫康定A0与B0的高效液相色谱图见图1。

1.纽莫康定A0 2.纽莫康定B0

2 结果与讨论

2.1 检测波长

通过二极管阵列检测器在线扫描，纽莫康定A0与B0均为末端吸收，当检测波长为214 nm时，二者均可得到满意的响应值。因此，确定检测波长为214 nm。

2.2 方法的线性范围

精密量取混合对照品贮备液7.5 mL、6.0 mL、5.0 mL、4.0 mL、2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀。6份溶液(含未稀释混合对照品贮备液)在1.4色谱条件下分别进样，记录峰面积，以相应的质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，拟合线性回归，得纽莫康定A0和B0的回归方程分别为：

YA0=2.17×105X+1.92×104，相关系数R=0.9997，线性范围为47.5～191.4 μg·mL-1；

YB0=2.06×105X+9.65×104，相关系数R=0.9998，线性范围为38.4～153.6 μg·mL-1。

2.3 精密度

精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样5次，记录纽莫康定A0与B0峰面积。结果表明，纽莫康定A0峰面积的RSD为0.94%，纽莫康定B0峰面积的RSD为0.92%。

2.4 灵敏度

取纽莫康定A0浓度为10.732 μg·mL-1、纽莫康定B0浓度为8.591 μg·mL-1的对照品溶液，进样5 μL测定。以信噪比为3所对应的样品量进行计算。结果表明，纽莫康定A0的检测灵敏度为6.86 ng、纽莫康定B0的检测灵敏度为5.95 ng。

2.5 稳定性

取同批号供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h进样测定。结果表明，纽莫康定A0峰面积的RSD为1.01%、纽莫康定B0峰面积的RSD为0.96%。表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.6 回收率

取9份已知纽莫康定A0和B0含量的发酵液50 mL，分别按高、中、低3组加入纽莫康定A0对照品及B0对照品(组1加入10.0 mg和8.0 mg；组2加入15.0 mg和12.0 mg；组3加入20.0 mg和16.0 mg)，每组3份，按1.3方法制备供试品溶液，进样10 μL，按色谱条件进样测定。计算得纽莫康定A0的平均回收率为99.15%(n=9)、RSD为0.96%；纽莫康定B0的平均回收率为99.31%(n=9)、RSD为0.98%。

2.7 重复性

取同批号发酵液，按1.3方法制备供试品溶液5份，进样10 μL，分别测定纽莫康定A0与B0峰面积，计算含量。结果表明，纽莫康定发酵液中A0平均含量为876.31 μg·mL-1，RSD为0.96%(n=5)；纽莫康定B0平均含量为682.74 μg·mL-1，RSD为0.94%(n=5)。

2.8 含量测定

精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL进样测定，测得3批纽莫康定A0含量(n=3)分别为862.48 μg·mL-1、877.46 μg·mL-1、871.59 μg·mL-1，RSD分别为0.95%、0.93%、0.94%；纽莫康定B0含量(n=3)分别为685.35 μg·mL-1、679.56 μg·mL-1、675.72 μg·mL-1，RSD分别为0.95%、0.93%、0.94%。

3 结论

建立了发酵液中纽莫康定A0和B0高效液相色谱检测方法。结果表明，纽莫康定A0的检测灵敏度为6.86 ng，纽莫康定B0的检测灵敏度为5.95 ng；纽莫康定A0浓度在47.5～191.4 μg·mL-1范围内与峰面积呈线性关系，纽莫康定B0浓度在38.4～153.6 μg·mL-1范围内与峰面积呈线性关系；纽莫康定A0的平均回收率为99.15%(n=9)、RSD为0.96%，纽莫康定B0的平均回收率为99.31%(n=9)、RSD为0.98%。该方法简便、准确、重现性好，可用于发酵液中纽莫康定A0和B0含量的同时测定。

[1] Hensens O D，Liesch J M，Zink D L，et al.Pneumocandins fromZalerionarboricola.Ⅲ.Structure elucidation[J].The Journal of Antibiotics，1992，45(12)：1875-1885.

[2] Stone E A，Fung H B，Kirschenbaum H L.Caspofungin：An echinocandin antifungal agent[J].Clinical Therapeutics，2002，24(3)：351-377，329.

[3] Chandrasekar P H，Sobel J D.Micafungin：A new echinocandin [J].Clinical Infectious Diseases，2006，42(8)：1171-1178.

[4] Ishikawa J，Maeda T，Matsumura I，et al.Antifungal activity of micafungin in serum[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53(10)：4559-4562.

[5] Pfaller M A，Messer S A，Boyken L，et al.Caspofungin activity against clinical isolates of fluconazole-resistantCandida[J].Journal of Clinical Microbiology，2003，41(12)：5729-5731.