王新帅，秦 玲，冯笑山，高社干，祁岩超

大量研究显示肿瘤患者免疫功能低下，肿瘤细胞通过多种机制逃逸机体免疫系统的识别［1］。树突状细胞(DCs)是体内最强的抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者。通过外源的肿瘤抗原负荷DCs增强其免疫性及抗原递呈作用，以DC 为基础的肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的研究热点。本研究采用负荷CEA-rV 负荷脐血来源的DC 后，再与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced kill cell，CIK)混合培养，观察CEA－rV－DC－CIK 对结肠癌细胞株Lovo 的杀伤活性，从而为CEA 阳性表达肿瘤细胞免疫治疗提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 IL-2、IFN-γ、GM-CSF(grannulocyte monocyte-colony stimulating factor)、TNF-α 及CD3 单抗购自美国Cytolab 公司;PGE2(Prostaglandin E2)购自美国Cayman 公司;鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 荧光抗体购自美国eBioscience 公司;RPMI 1640 购自美国Gibco 公司;MTT 购自美国Sigma 公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物公司;淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液病研究所;蛋白提取试剂盒购自中国康成生物公司;人结肠癌细胞株Lovo 由广州医学院肿瘤研究所提供;酶标仪为美国Thermo Labsystem 生产的MK3 型。

1.2 实验方法

1.2.1 CEA-rV 的制备及滴度测定 CEA-rV 的制备及滴度测定依照参考文献［2］中方法进行，进行滴度测定后置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 脐血的采集和分离 脐血样本来自广州市荔湾医院，共10 份。其孕母HBV、HCV、HIV 和梅毒检测阴性。用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cells，CBMC)。

1.2.3 DC 和CIK 的诱导 ①DC 的诱导:取分离的CBMC 置入6 孔培养板，2 h 后吸出悬浮细胞，贴壁细胞中加入20 ng/mL IL-4 和100 ng/mL GM-CSF，隔天换液，诱导培养前期加入CEA-rV，后期加入20 ng/mL TNF-α 和1 μg/mL PGE2。②CIK 的诱导:悬浮细胞中加入1 000 μg/mL IFN-γ、500 ng/mL CD3单抗、200 μg/mL IL-2，每2 ～3 d 传代培养1 次，传代时补加细胞因子。……