刘志刚，刘永芳，陈雪君，赵博，吴迪，周芳

(1.武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060;2.武汉市第一医院 麻醉科，湖北武汉 430060)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是临床上各种疾病、休克、创伤及体外循环心血管手术等过程中常见的损伤，由多种细胞内信号途径参与并介导。研究发现，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与心肌缺血再灌注损伤具有密切关系。VEGF是一种分泌性糖蛋白，可经缺血缺氧诱导产生，与其受体结合后具有促进内皮细胞增生、迁移，增加血管通透性和加速新血管形成的作用，并对缺血心肌具有保护效应［1］。

Kawata等［2］的研究表明，吸入麻醉药异氟醚预处理的心肌保护作用与VEGF表达上调有关，其中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)家族是介导预适应保护作用的重要途径，但其具体的作用机制不明。本实验通过观察临床常用吸入性麻醉药异氟烷对培养大鼠心肌细胞VEGF分泌及PKC亚型表达的影响，旨在进一步探讨异氟烷心肌保护的分子机制，为围手术期心肌保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品

PKC抑制剂calphostin C(Sigma公司，美国)，5'-溴脱氧尿苷(Sigma公司，美国)，异氟烷(Abbott公司，美国)，高糖DMEM培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(Hyclone公司，美国)，兔抗鼠 PKCα、PKCδ、PKCζ和PKCε抗体(Santa Cruz公司，美国)，羊抗兔 IgG(Santa Cruz公司，美国)，PVDF蛋白印迹膜(Bio-Rad公司，美国)，化学发光试剂盒(Pierce公司，美国)，BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce公司，美国)，VEGF酶联免疫试剂盒(R＆D Systems公司，美国)，其他试剂均为Sigma公司产品。

1.2 心肌细胞分离培养

取1～3 d新生SD大鼠，雌雄不拘，对文献［3］的方法略作改良来分离培养心肌细胞。无菌条件下开胸取出心室肌，清洗后加入0.05%胶原酶、0.08%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，分次消化、离心，以15%胎牛血清的高糖DMEM悬浮细胞，差速贴壁法去除成纤维细胞。……