林玉丽，华子春

(南京大学医药生物技术国家重点实验室，江苏南京 210093)

血管新生是实体肿瘤所必需的，对肿瘤的生长和增殖具有重要作用［1］。抗血管形成以肿瘤组织内部快速生长发展的微血管系统为靶点，由于血管内皮细胞在遗传上更加稳定，大量长时间给药情况下不易产生耐药性，因此抗血管形成治疗已成为极有前景的癌症治疗方法［2－3］。已有的实验证明，血管生成抑制剂如endostatin［4］、angiostatin［5］、vasostatin［6］和 tumstatin［7］能靶向抑制血管内皮细胞增殖，进而阻止肿瘤生长。

vasostatin为钙网蛋白calreticulin N端1-180氨基酸的结构域，是一种血管生成抑制剂，研究表明其在动物模型体内具有抗淋巴瘤效果［6］。它能特异地抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖、抑制新生血管生成，能够阻止或减慢实验性肿瘤的生长［8］。大量实验证明，它是一种具有潜在药用价值的短肽［6，8－9］。vasostatin蛋白目前主要通过原核表达系统获得，由于它在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的、不溶性的包涵体产物，因而成为其基因工程生产的瓶颈环节［10－12］。本研究将vasostatin基因克隆在酵母诱导型表达载体pPIC9K中，在毕赤酵母中进行高效表达，并对表达产物进行分离纯化，对其抑制血管生成活性进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

PET28a(+)质粒、大肠杆菌 E.coli Top10、A549细胞(本实验室保存)，毕赤酵母菌株KM17、酵母诱导型表达质粒 pPIC9K(Invitrogen公司，Life science)，PCR试剂、XhoⅠ、NotⅠ、SacⅠ、Taq DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、Pyrobest DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)。柱离心式质粒小提试剂盒、柱离心式胶回收小提试剂盒(上海申能博彩公司)，Western Blotting化学发光试剂盒(PE公司)，羊抗人calreticulin多抗、CD31多抗(Santa Cruz公司)，MTT(Sigma公司)，Agarose(GENE公司)，DEAESepharose Fast Flow(GE公司)，Tryptone、Yeast Extract、SDS、Tris、丙稀酰胺、亚甲叉丙稀酰胺(上海生工生物工程技术服务有限公司)。……