胡 薇 孟星宇 田玉华 刘 宁

(吉林农业大学，长春，130118)

鹿茸是鹿的第二性征，是在一定生理条件下额骨部长出的骨质性组织，其生长发育受特定的分子机理调控。即鹿茸的独特之处就在于它的每年更新，这在哺乳动物中绝无仅有，因而其成为研究器官再生的理想模型［1－2］。鹿茸生长速度为每天1～2 cm，是任何哺乳动物组织和器官无法比拟的，其相应表皮层也生长很快，以便覆盖新增长的骨质［3］。因此，人们推测其中可能存在特殊的促进骨和上皮组织快速生长的活性物质，控制并刺激鹿茸的生长。早在1991年，新西兰学者Suttie等［4］就发现，一种对多种细胞和组织增殖具有刺激作用的多肽类物质——胰岛素生长因子(insulin－like growth factor，IGF)，可能是促进鹿茸生长的刺激因子。其中，IGF1和IGF2是有效的促进骨细胞分裂剂，但IGF2对成骨细胞的作用较 IGF1 弱［4］。Rosen［5－6］等学者也证明 IGF1 在体内有促进骨形成的作用。因此，IGF1既可促进成骨细胞的骨形成作用，又可促进破骨细胞的骨吸收作用，在骨重建过程中起着重要作用。目前，已从许多动物体组织中分离得到IGF1，并且各类动物的IGF1基因序列和氨基酸序列在NCBI数据库中均可以检索到。但是，未见有关东北梅花鹿IGF1基因全长cDNA方面的报道，而IGF1mRNA的表达调控研究更少。但由于mRNA水平的定量检测是反映IGF1合成、分泌最直接、最灵敏的途径，对进一步研究IGF1的功能具有重要的促进作用。因此，本研究旨在通过梅花鹿IGF1基因编码区全长cDNA的克隆与序列分析，以及利用相对荧光定量Real Time PCR技术检测鹿茸顶端组织IGF1基因的mRNA表达水平，为深入研究IGF1的功能及对鹿茸生长的调节作用提供可参考的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜东北梅花鹿鹿茸于2010年6月采自吉林农业大学试验鹿场1头3岁左右的健康雄鹿，保存于液氮中带回实验室备用。TRIzoL试剂购自Invitrogen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ、DL－2000 Marker购自 TaKaRa公司，Real Master Mix购自长春宝泰克公司。

1.2 样品制备

根据组织结构和生长特点，将鹿茸顶端组织大致分为真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层［7］。使用消毒处理过的手术刀在离鹿茸顶端4 cm处沿垂直鹿茸生长轴方向切断，切取真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层组织各100 mg，于液氮中保存。

1.3 鹿茸顶端组织总RNA提取与双链cDNA的获得

按照Trizol操作手册分别提取真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层样品总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光法检测总RNA质量。以提取的总RNA为模板，以Oligo－dT为引物，以逆转录酶AMV反转录合成双链cDNA。

1.4 IGF1基因全长cDNA克隆与序列分析

参照GenBank中相关序列，设计IGF1基因特异性引物(上游引物:ATGGGAAAAATCAGCAGTCTT和下游引物:CTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCT)，以软骨组织cDNA为模板进行PCR扩增，利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收产物连接到pMD18－T载体上，转化大肠杆菌DH5α中，涂板并于37℃培养。挑取转化菌落，接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，采用碱裂解法小量提取质粒并将鉴定正确的重组质粒送TaKaRa公司测序。获得的梅花鹿IGF1基因序列递交GenBank(登录号:HQ890468)。并将测序结果分别与GenBank中马鹿(EF_157842)、牛(NM_001077828)、羊(NM_001009774)、马(EU018459)、猪(DQ784687)、人(NM_000618)和小鼠(NM_001111275)的序列进行同源性分析。

1.5 相对荧光定量PCR法检测IGF1基因在鹿茸顶端组织的表达丰度

合成用于IGF1基因的特异引物(上游引物5＇－TGTGATTTCTTGAAGCAGGTGA －3＇和下 游引物 5＇－ CGTGGCAGAGCTGGTGAAG－3＇)，扩增片段长度为96 bp。以鹿的持家基因actin(GenBank登录号:AY345228)作为内参基因，合成actin引物(上游引物5＇－TGACCCTTAAGTACCCCATCGA－3＇和下游引物 5＇－ TTGTAGAAGGTGTGGTGCCAGAT －3＇)，扩增片段长度为85 bp。IGF1探针序列为(5＇－TGCCCGTCACATCCTCCTCGC – 3＇)。

以鹿茸组织cDNA为模版，PCR分别扩增IGF1和actin。PCR 体系:cDNA 模板6.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，PCR Mix 15 μL，ddH2O 3.0 μL，总体积为 25 μL。反应条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30 个循环。采用Real Master Mix试剂和7500 Real Time PCR System分析IGF1基因在真皮、间充质、前软骨和软骨组织中的表达丰度。Real－time PCR体系:1 ng总RNA反转录的cDNA，上下游引物各 5 pmol，10 μL real Master Mix，总体积为 25 μL。反应条件:94℃激活DNA聚合酶2 min;94℃变性20 s;60℃复性30 s;68℃延伸45 s;进行40个循环。随后做PCR产物的扩增曲线分析，使用StepOne Software v2.1软件分析IGF1相对内参actin基因的差异表达Ct值(Ct为荧光达到荧光阈值的循环数)。

2 结果与分析

2.1 鹿茸顶端组织总RNA的提取

各样品总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，28 S、18 S和5 S 3条带清晰可见(图1)，表明所提取的鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA质量符合定量PCR分析用标准，未发生RNA明显降解。

2.2 IGF1基因的全长cDNA克隆

IGF1基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳得到约465 bp的1条特异性条带(图2)，与预期结果相符。提取重组质粒，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pMD－18T－IGF1(图3)，从图3中可看出，可获得与目的带大小相符的电泳条带465 bp，表明克隆基本成功。

图1 鹿茸顶端组织总RNA提取结果

图2 IGF1基因的PCR扩增结果

图3 重组质粒pMD－18T－IGF1双酶切鉴定结果

2.3 IGF1基因的全长cDNA序列分析

梅花鹿IGF1基因与GenBank中马鹿、牛、羊、马、猪、人和小鼠的核苷酸和氨基酸序列Blast分析结果显示:梅花鹿IGF1基因编码区全长cDNA为465 bp，其中与马鹿、牛和羊的序列同源性最高，核苷酸序列同源性分别为99.78%、98.28%和97.85%(图4);氨基酸序列同源性分别为 99.35%、98.05%和97.40%(图5)，肽链长度均为154个氨基酸;而马、猪、人和小鼠4个物种IGF1的核苷酸序列为462 bp，肽链长度皆为153个氨基酸。

图4 梅花鹿、马鹿、牛、羊、马、猪、人及小鼠IGF1基因核苷酸序列分析结果

图5 梅花鹿、马鹿、牛、羊、马、猪、人及小鼠IGF1氨基酸序列分析结果

2.4 IGF1基因在鹿茸顶端组织中的表达丰度

以鹿茸顶端组织cDNA为模版，PCR分别扩增actin和IGF1。actin扩增长度为85 bp，IGF1扩增片段长度为96 bp，见图6。利用Real time PCR的方法，使用梅花鹿actin作为内源参照基因，每个样本做3个重复，检测IGF1基因在鹿茸组织不同部位的表达丰度。图7为IGF1基因相对荧光定量PCR扩增曲线，从图中可看出，荧光定量动力学曲线指数区明显，斜率较大且固定，应为较理想的扩增曲线，说明荧光定量PCR方法检测的结果具有较好的灵敏性和准确性。通过数据统计分析发现，在鹿茸顶端组织不同部位IGF1基因mRNA表达水平存在明显的表达差异，间充质、真皮、前软骨和软骨组织中IGF1基因的表达量呈递增趋势，见表1。

图6 IGF1和actin的PCR扩增结果

3 讨论

近年来，许多学者利用分子生物学、细胞生物学、组织胚胎学等技术从基因、蛋白质、细胞等角度研究了鹿茸再生问题，特别是鹿茸软骨骨化过程的组织学特性已经得到深入研究［8］。但关于鹿茸发育的分子机理，至今仍不十分清楚。而胰岛素样生长因子等细胞因子对鹿茸生长的作用还缺乏详细的基础试验数据。已知IGFs包括IGF1和IGF2，是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，对机体生长发育起着重要调节作用［9－10］。IGFs能促进成骨细胞分化、增殖，对鹿茸的生长起重要作用，目前已经得到学者的普遍认可［11－12］，但由于其调控机理非常复杂，并且对IGF1基因mRNA的表达调控研究相对较少，这在一定程度上也反映出国内外对于该领域的研究较为缓慢。

图7 IGF1基因的PCR扩增曲线

近来许多动物和人的IGF1已经研究得较透彻，但Gen－Bank中关于鹿类生长因子基因序列的检索较少，梅花鹿IGF1基因编码区全长cDNA尚未得到克隆。本文根据马鹿、牛和羊的IGF1基因序列设计引物，通过RT－PCR技术克隆了IGF1基因cDNA全部编码序列，并获得GenBank登录号。其开放阅读框为465 bp，该序列与其它7个物种的IGF1核苷酸序列高度同源，其中与马鹿的IGF1核酸序列同源性最高;氨基酸序列同源性分析显示:梅花鹿IGF1基因共编码154个氨基酸，与马鹿、牛和羊IGF1肽链的结构完全一致，其它4个物种马、猪、人和小鼠IGF1肽链为153个氨基酸，这说明IGF1进化非常保守。在梅花鹿IGF1氨基酸序列中具有与其它7个物种相同的6个保守的半胱氨酸残基，可形成3个二硫键，这对于维持IGF1的空间结构起到关键作用。

表1 鹿茸顶端不同组织IGF1基因表达水平的检测结果(n=3±s)

表1 鹿茸顶端不同组织IGF1基因表达水平的检测结果(n=3±s)

注:Ct代表荧光达到荧光阈值的循环数;2－ΔΔCt2代表目的基因相对于内参基因的定量。

顶端组织actin扩增循环数(Ct1)IGF1扩增循环数(Ct2)相对定量结果(2 －ΔΔCt2)以间充质表达量为1标准化间充质11.470 ±0.156 1 25.268 ±0.317 0 0.000 1 1.000真 皮 17.239 ±0.115 0 28.724 ±0.367 5 0.000 3 4.969前软骨 17.861 ±0.144 7 28.300 ±0.262 0 0.000 7 10.260软 骨17.953 ±0.424 0 27.912 ±0.164 8 0.001 0 14.310

检测基因表达水平的方法有Northern杂交、原位杂交和定量PCR等多种方法，但这些方法很难对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术不仅达到了PCR从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为基因工程研究中的重要工具［13］。本文利用 Real time PCR方法，以梅花鹿actin作为内源参照基因，对梅花鹿IGF1在鹿茸顶端4种不同组织进行了表达水平分析。结果表明:IGF1在检测的所有组织中均有不同程度的表达，该结果具有很好的重复性和稳定性，且检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量，相对半定量RT－PCR中的比较值更为准确可靠。同时分析发现:IGF1在软骨和前软骨组织中表达量最高，真皮层和间充质层中表达量较低。已有研究提示:在鹿茸快速生长期，IGF1对软骨生长过程的影响较大，软骨组织骨化速度超过茸皮层组织生长速度，这进一步说明IGF1是鹿茸再生过程中软骨生长的主效因子之一。总之，本文只是针对IGF1基因在东北梅花鹿这个物种上进行了初步的研究，获得可供参考和利用的基础试验数据，但要将IGF1的功能研究透彻，还需今后国内外学者大量的实验研究去证实。

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