张海祥，方婷婷，潘文娟，廖爱美,2，魏兆军,*

响应曲面法优化尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸的工艺

张海祥1，方婷婷1，潘文娟1，廖爱美1,2，魏兆军1,*

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥师范学院生命科学系，安徽 合肥 230061)

采用响应曲面法对尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸工艺进行优化。以α-亚麻酸纯度为响应值，温度、尿素与脂肪酸比值、95%乙醇与脂肪酸比值和包合时间为试验因素，进行中心组合试验。结果表明，α-亚麻酸富集最优工艺条件为温度-8.27℃、尿素与脂肪酸比值3.39、95%乙醇与脂肪酸比值10.47、包合时间8.91h，α-亚麻酸纯度达70.28%。尿素包合法是富集蚕蛹油α-亚麻酸有效的方法。

蚕蛹油；α-亚麻酸；尿素包合

α-亚麻酸(alpha-linolenic acid，ALA)为全顺式十八碳-9,12,15-三烯酸，分子式为C18H30O2，是ε-3系列多不饱和脂肪酸，属于必需脂肪酸，人体不能自身合成，需要从食物中补充。α-亚麻酸具有降血压、降血脂、抗血栓、抗过敏的功效，能够预防心血管疾病、增强免疫力、增长智力和延缓衰老，α-亚麻酸是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前体，如果缺乏会影响智力和视觉敏锐度[1-6]。蚕蛹油中不饱和脂肪酸含量达66.8%，其中α-亚麻酸含量27.99%，是一种优质的α-亚麻酸来源[7-9]。

由于大多数动植物中α-亚麻酸含量较低，而α-亚麻酸只有达到一定纯度后才能表现出典型的生理活性，所以需要对其进行富集纯化。目前，α-亚麻酸富集方法有硝酸银络合法、分子蒸馏和尿素包合法等方法。张海满等[10]采用尿素包合法纯化亚麻油中α-亚麻酸，使其质量分数由46.7%提高到87.3%，收率53.3%。杨克迪等[11]采用硝酸银络合萃取蚕蛹油α-亚麻酸酯，所得产品中α-亚麻酸酯纯度达到97.9%，收率44.3%。李婷婷等[12]采用分子蒸馏技术富集猕猴桃籽油中α-亚麻酸，使其质量分数提高到83.67%，四级分子蒸馏后α-亚麻酸质量分数达到86.27%。总体来看，硝酸银络合法得到的亚麻酸纯度高，但是硝酸银价格昂贵，浓缩产品中有Ag+残留；分子蒸馏工序简单，效率较高，但设备投入较大，要得到高纯度亚麻酸需要多级分子蒸馏，回收率变低[13]。尿素包合法具有成本低廉、工艺简单、操作温度低等优点，是一种简单有效的多不饱和脂肪酸富集方法。本研究利用从缫丝厂蚕蛹中提取的蚕蛹油为原料，采用响应曲面方法对尿素包合富集α-亚麻酸进行工艺优化，以期使蚕蛹油α-亚麻酸得到富集纯化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕蛹(缫丝后的下脚料) 安徽双龙丝绸有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-S恒温水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司；EP2134C型分析天平 上海奥豪公司；Allegra 64R型离心机 美国贝特曼库尔特有限公司；QP2010型GCMS分析仪 日本岛津公司。

1.3 蚕蛹油提取及混合脂肪酸制备方法

缫丝厂下脚料蚕蛹烘干后粉碎，经超临界CO2萃取蚕蛹油。蚕蛹油提取工艺为萃取压力324.5Pa、萃取温度39.6℃、萃取时间131.2min、CO2流量19.3L/h，在此条件下出油率为29.73%[1]。

称取200g蚕蛹油缓慢加入到1000mL 3.7%氢氧化钠乙醇溶液中，60℃水浴搅拌皂化1h，静置至室温后加蒸馏水至溶液澄清，用浓盐酸调溶液pH2～3，加入正己烷于分液漏斗中萃取两次，静置弃水层，蒸馏水水洗至中性，有机相用无水硫酸钠脱水后60℃旋转蒸发去除正己烷，即得混合脂肪酸[14]。

1.4 尿素包合富集α-亚麻酸工艺

按设定的比例将尿素和95%乙醇加入到250mL三角烧瓶中，尿素于80℃水浴中完全溶解后放入60℃水浴中，将混合脂肪酸在60℃水浴中预热后取10g加入到三角烧瓶中，摇匀后在室温下静置20min后在设定温度下进行包合反应，一段时间后取出迅速抽滤，滤液用4mol/L盐酸调pH2～3，正己烷萃取两次，水洗至中性，旋转蒸发，得到包合后脂肪酸。

1.5 气相和质谱联用(GC-MS)分析脂肪酸组分

取包合后脂肪酸20μL加入4mL H2SO4-CH3OH(1:7，V/V)溶液，放入恒温振荡摇床中，38℃、130r/min酯化12h，用正己烷萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤多次，采用无水Na2SO4干燥，6000r/min离心20min后，取上清液进行GC-MS分析。

色谱条件：色谱柱DB-WAX(30m×0.25mm，0.25 μm)；程序升温，初温200℃，保持2min，3℃/min升温至230℃，保持3min，进样口温度250℃，检测器温度260℃，载气为高纯氦(He)，流速1.5mL/min；进样量1.0μL，分流比为50。质谱条件：电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV，接口温度250℃，电子倍增器电压1.1kV，扫描范围20～800u[1]。

1.6 数据设计与统计分析

采用响应曲面法(RSM)来优化尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸工艺[1]，以温度、尿素与脂肪酸比值、95%乙醇与脂肪酸比值、包合反应时间为自变量，以α-亚麻酸纯度为响应值，响应曲面设计中各变量的编码和相对应的非编码值见表1。应用SAS 9.2进行基于中心组合旋转设计(CCRD)的响应曲面设计，试验共有31种组合，其中16(24)组二水平析因点试验，8组星点试验和7组中心点试验，具体的试验设计方案及结果见表2。为了减少不必要的误差，所有试验按任意的顺序进行，除中心点试验(0，0，0，0)外，所有试验重复3次。设该模型的二次多项方程为：

式中：Y为预测响应值，即α-亚麻酸纯度/%；β0、βi、βii、βij分别为常数、一次项、二次项和交互作用项系数。应用SAS9.2软件对试验结果进行统计分析，对其进行响应曲面分析优化，以获得尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸的最佳工艺条件参数。

基于在前期单因素预试验基础上选择响应面设计因素水平，单因素试验时，温度0℃、尿素与脂肪酸比值3g/g、95%乙醇与脂肪酸比值14(mL/g)、包合反应时间10h为较优条件，因此，以这些值作为中心点的水平，具体因素水平见表1。

表1 尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸的响应面试验因素水平及编码Table 1 Coded and corresponding actual levels of independent variables in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 响应曲面分析与优化尿素包合法富集蚕蛹油α-亚麻酸

中心组合试验结果见表2，方差分析结果见表3，模型的R2=85.76%，说明试验数据很好地拟合了模型。对试验数据进行回归分析，得到四元二次回归方程为：

表2 尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸响应曲面试验设计及结果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

表4中心组合试验结果回归分析表明，X1、X2线性效应及X12、X22显著(P＜0.05)，根据方差分析和回归方程系数显著性检验的结果，将差异不显著的因素剔除后得到的回归模型方程为：

表3 中心组合试验结果方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation for α-linolenic acid in urea inclusion compounds

表4 中心组合试验结果回归分析表Table 4 Significance test of each term of the regression equation for α-linolenic acid in urea inclusion compounds

在试验水平范围内，利用响应曲面得到的最优工艺条件为温度-8.27℃、尿素与脂肪酸比值3.39、95%乙醇与脂肪酸比值10.47、包合反应时间8.91h，在此条件下α-亚麻酸纯度70.28%。

图1 温度与尿素与脂肪酸比值的交互作用对α-亚麻酸纯度的影响Fig.1 Three-dimensional response surface diagram for the interactive effects of reaction temperature and the ratio of urea to fatty acids on α-linolenic acid in urea inclusion compounds

由图1可以看出，随着温度的降低和尿素用量的增多，α-亚麻酸纯度先增加，增大到一定程度后开始减小，在温度-10℃，尿素与脂肪酸比值为3左右，α-亚麻酸纯度有最大值。

2.2 模型方程的验证

利用响应曲面优化得到的工艺条件进行重复实验，温度-8.27℃、尿素与脂肪酸比值3.39、95%乙醇与脂肪酸比值10.47、包合反应时间8.91h，在此条件下α-亚麻酸纯度达70.42%，与预测值非常接近。对比尿素包合前后蚕蛹油脂肪酸的GC图(图2)及脂肪酸组分表(表5)，可以看出α-亚麻酸得到了很好的富集，尿素包合后不饱和脂肪酸含量达97.24%。

图2 蚕蛹油脂肪酸GC图(A)与尿素包合后脂肪酸GC图(B)Fig.2 GC profiles of silkworm pupal oil before and after urea adduction fractionation

表5 包埋后蚕蛹油主要脂肪酸组分Table 5 Comparisons of main fatty acid constituents in silkworm pupal oil before and after urea adduction fractionation

3 结 论

采用响应曲面法对尿素包合富集蚕蛹油α-亚麻酸工艺进行优化。分析结果表明，温度和尿素与脂肪酸比值的线性效应对α-亚麻酸纯度的影响达到极显著水平，一定范围内降低温度，增加尿素用量都可以提高α-亚麻酸纯度，得到数学模型：Y=-29.41-0.984X1＋48.42X2＋1.6X3-0.011X12-6.698X22。

α-亚麻酸富集最优工艺条件为温度-8.27℃、尿素与脂肪酸比值3.39、95%乙醇与脂肪酸比值10.47、包合反应时间8.91h，α-亚麻酸纯度达70.28%。

[1]WEI Zhaojun, LIAO Aimei, ZHANG Haixiang, et al. Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of silkworm pupal oil applying the response surface methodology[J]. Bioresour Technol, 2009, 100(18): 4214-4219.

[2]李加兴, 李忠海, 刘飞, 等. α-亚麻酸的生理功能及其富集纯化[J].食品与机械, 2009, 25(5): 172-177.

[3]马养民, 杜小晖, 冯成亮. α-亚麻酸提取纯化方法的研究进展[J]. 粮油加工, 2008(10): 69-72.

[4]龚雪龙, 司马杨虎, 孙晓飞. 家蚕蛹脂肪酸成分的气相色谱-质谱联用分析[J]. 蚕业科学, 2010, 36(1): 186-189.

[5]BEGG D P, SINCLAIR A J, STAHL L A, et a1. Hypertension induced by omega-3 polyunsaturated fatty acid deficiency is alleviated by alphalinolenic acid regardless of dietary source[J]. Hypertension Research, 2010, 33(8): 808-813．

[6]PEREIRA N R, FERRARESE O, MATSUSHITA M, et a1. Proximate composition and fatty acid profile of Bombyx mori L. chrysalis toast[J]. J Food Compost Anal, 2003, 16(4): 451-457．

[7]廖爱美 蚕蛹油的提取工艺优化、组分分析及其功能评价[D]. 合肥:合肥工业大学, 2009.

[8]魏兆军, 姜绍通. 蚕食用化研究进展[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 592-596.

[9]魏兆军, 廖爱美, 于力涛, 等. 家蚕蛹油提取工艺优化研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 248-251.

[10]张海满, 刘福祯, 戴玲妹. 尿素包合法纯化α-亚麻酸工艺研究: Ⅰ[J]. 中国油脂, 2001, 26(2): 41-44.

[11]杨克迪, 胡小明, 黄海基, 等. 硝酸银络合萃取蚕蛹油α-亚麻酸酯[J]. 中国油脂, 2008, 33(1): 30-32.

[12]李婷婷, 吴彩娥, 许克勇, 等. 分子蒸馏技术富集猕猴桃籽油中α-亚麻酸[J]. 农业机械学报, 2007, 38(5): 96-99.

[13]张四喜, 邓树海, 宋燕青, 等. 蚕蛹油α-亚麻酸的纯化与气相色谱含量测定方法研究[J]. 药物分析杂志, 2007, 27(4): 535-538.

[14]毛多斌, 贾春晓, 金保全, 等. 省沽油种子油中脂肪酸的GC-MS分析[J]. 中国油脂, 2004, 29(3): 64-66.

Optimization of the Enrichment of Alpha-Linolenic Acid in Silkworm Pupal Oil by the Method of Urea Adduction Fractionation

ZHANG Hai-xiang1，FANG Ting-ting1，PAN Wen-juan1，LIAO Ai-mei1,2，WEI Zhao-jun1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Department of Life Science, Hefei Normal University, Hefei 230061, China)

Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the enrichment of α-linolenic acid in silkworm pupal oil by the method of urea adduction fractionation. This optimization was carried out based on our previous investigations on the effects of four process parameters, namely reaction temperature and time, the ratio of urea to fatty acids, and the ratio of 95% ethanol to fatty acids on α-linolenic acid content in urea inclusion compounds by single factor method, and the results showed that the optimum levels of the four parameters were determined to be -8.27 ℃, 8.91 h, 3.39:1 and 10.47:1, respectively. Under the optimum conditions, the content of α-linolenic acid in urea inclusion compounds was up to 70.28%. Urea adduction fractionation is an effective method for the enrichment of α-linolenic acid.

silkworm pupal oil；α-linolenic acid；urea adduction fractionation

R284.1

A

1002-6630(2011)04-0074-04

2010-10-25

安徽省“十一五”科技攻关计划项目(08010302149)；江苏省“十一五”科技支撑计划项目(农业BE2009365)；教育部新世纪优秀人才基金项目(NCET-07-0251)

张海祥(1980—)，男，硕士研究生，研究方向为功能食品和生物技术。E-mail：zhx105020@163.com

*通信作者：魏兆军(1970—)，男，教授，博士，研究方向为功能食品。E-mail：zjwei@hfut.edu.cn