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灵五颗粒保肝退黄降酶作用研究*

2011-06-01徐雪钰刘军于珊刘青川程丽娟黄正明

医药导报 2011年8期
关键词:低剂量肝细胞批号

徐雪钰,刘军,于珊,刘青川,程丽娟,黄正明

(1.解放军第309医院药学部,北京 100091;2.解放军第302医院药剂科,北京 100039)

灵五颗粒(lingwu granules,LW)由菌草灵芝和五味子等中药配伍而成。该药在临床应用多年,具有扶正活血、疏肝利胆、保肝等功效,主治急慢性乙型肝炎、肝炎后高胆红素血症等症,疗效明显。为方便患者用药,笔者采用了现代科学技术,将其精制成颗粒剂。此前实验证实,LW对D-半乳糖胺致小鼠急性肝实质细胞损伤具有明显的保肝降酶作用[1]。由于该药还具有治疗肝炎后高胆红素血症等效果,笔者在本实验利用经典 α-萘异硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate,ANIT)致小鼠黄疸性肝损伤模型观察LW保肝退黄降酶的作用。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠,无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,体质量 18 ~22 g,购自军事医学科学院实验动物中心,动物合格证号:SCXK-(军)-2007-004。

1.2 试药 LW[解放军第302医院自制,批准文号:总L(2001)第0001号,批号:091225,规格:每袋 10 g],茵栀黄颗粒(鲁南侯普制药有限公司,批号:0909704),均现用现配。ANIT(解放军防化研究院第四研究所提供,批号:070512),花生油(购自丰台华堂商场),丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,T-BiL)试剂盒(购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,批号分别 为 110208005,100610001,20100325),丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(批号分别为 20100421,20100421),谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒(批号:20100831)等均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 85-2型恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司),722光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂),台式离心机(上海安亭科学仪器厂),BS-120全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司),病理切片机、生物显微镜(日本Olympus公司产品),FA2004分析天平(上海天平仪器厂)。

2 方法

2.1 动物分组与给药 健康昆明种小鼠108只(分3批,每批36只),在解放军第302医院标准(Ⅱ级)动物实验室饲养并观察2 d,然后进入实验,随机分为6组,每组6只。正常组(0.9%氯化钠溶液),模型组,ANIT+茵栀黄颗粒组(10 g·kg-1,阳性对照组)LW高、中、低剂量组(ANIT+LW 10,5,2.5 g·kg-1)。各给药组分别按0.02 mL·g-1灌胃给药,每天1次,连续给药7 d。正常组和模型组分别灌胃给予与LW高剂量等体积的0.9%氯化钠溶液。末次给药1 h后,除正常组外,其余各组均灌胃给予0.02 mL·g-1ANIT花生油105 mg·kg-1,制备小鼠黄疸型肝损伤模型。待中毒后继续给药1 d,中毒48 h后经眼球取血并处死小鼠,取出肝脏,一部分做抗氧化指标检测,另一部分做肝病理学切片,镜检观察。

2.2 观察指标与观察方法

2.2.1 肝功能 眼球取血,将血液静置 3 h,3 000 r·min-1离心 10 min(离心半径:5 cm),分离上层血清,全自动生化分析仪测血清ALT、AST活性及T-BiL含量。

2.2.2 肝组织氧化与抗氧化指标 剪取肝组织右叶一块,于冰盐水中漂洗,滤纸吸干,称取0.2 g,放入玻璃匀浆管中,制成10%肝组织匀浆,测定肝匀浆中MDA含量和SOD活力。

2.2.3 组织病理学 从肝右叶剪一小块组织,用10%甲醛溶液固定,固定好的肝组织由解放军第302医院病理科做组织切片,光镜下观察肝脏组织病理学变化。

3 结果

3.1 LW对黄疸型肝损伤小鼠胆红素及转氨酶的影响3批实验结果均表明,与正常组比较,模型组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均明显升高。LW中、高剂量组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均显著低于模型组,LW低剂量组T-BiL含量亦显著降低。LW各剂量组间肝功改善结果具有良好的量效关系(表1)。阳性对照组小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均显著低于模型组。

3.2 LW抗肝损伤组织氧化作用 实验结果表明,与正常组比较,模型组小鼠肝脏MDA含量显著增加,SOD活力和GSH含量显著降低。与模型组比较,LW中、高剂量组肝组织MDA含量显著降低,SOD活力显著升高,见表1。

3.3 肝组织病理学改变 光镜下,正常组肝组织结构清晰,肝小叶结构完整,肝细胞以中央静脉呈条索状排列,整齐有序,大小一致,细胞核大而圆,核膜清晰,汇管区肝胆管清晰可见(图1A);模型组肝细胞酸性变性,汇管区胆管上皮细胞中度肿胀、坏死,管腔重度狭窄,大量炎性细胞浸润,肝小叶结构不清(图1B);阳性对照组肝小叶结构较完整,仅见个别肝细胞嗜酸性变,汇管区胆管上皮细胞轻度肿胀、无明显坏死,另有轻度的炎性细胞浸润(图1C);LW高剂量组肝小叶结构完整,清晰可见,未见肝细胞嗜酸性变,汇管区较清晰,胆管上皮细胞可见轻微肿胀,未见坏死,管区周围有少量炎性细胞浸润,中央静脉及肝窦清晰(图1D);LW中剂量组肝小叶结构较完整,肝细胞呈轻至中度变性,坏死,炎性反应呈轻度变化,肝组织病变程度与阳性组相似(图1E);LW低剂量组肝细胞可见嗜酸性变,汇管区炎性反应较重,胆管上皮细胞可见明显肿胀,轻度管腔狭窄(图1F)。

表16 组小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH测定结果Tab.1 The serum levels of ALT,AST,T-BiL,MDA,SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

表16 组小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH测定结果Tab.1 The serum levels of ALT,AST,T-BiL,MDA,SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

ALT/(U·L-1)6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%AST/(U·L-1)第1批(n=6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%LW高剂量组 61.2±43.4*1 423.6±22.2*2 46.5±20.4*1 71.0 166.7±133.6*2 258.1±76.7*2 220.0±88.1*1 60.0中剂量组 111.6±57.3*2 144.4±42.1*2 51.4±18.5*1 57.0 231.2±89.6*2 430.0±130.9 168.3±28.5*1 49.0低剂量组 166.0±103.7*2 195.9±140.3 46.9±28.2*1 43.0 320.3±148.3 370.1±70.8 134.7±67.6*1 49.0 ANIT+茵栀黄颗粒组 169.5±36.2*1 72.2±52.8*2 115.5±59.6*1 50.0 353.3±72.6 180.0±103.6*2 312.1±157.1*1 48.0模型组 234.0±53.8 230.2±78.4 250.5±36.7 … 431.4±116.6 460.7±132.1 730.3±103.9 …正常组 7.9±1.0*1 7.8±0.3 7.1±1.4 … 33.2±3.8 30.9±4.7 33.5±4.9…

续表1 6组小鼠血清ALT、AST、T-BiL测定结果

4 讨论

笔者在本实验中采用ANIT造模后,血清 T-BiL、ALT、AST明显升高,48 h达峰值,肝病理镜检结果证实,肝实质细胞和肝内胆管损伤严重,表明造模成功,与文献报道一致[2-7]。3批重复性实验结果表明,LW组小鼠血清T-BiL、ALT、AST水平均显著低于模型组,并呈现明显的剂量依赖性,结合肝病理变化较轻等,说明LW对造成的肝损伤具有较好的保护作用,退黄降酶效果明显。与正常组比较,模型组肝脏SOD活性明显降低,MDA含量明显升高。这表明ANIT作为外源性过氧化物在肝脏转化,经氧化还原后在肝内产生多种自由基,导致组织过氧化损伤。而LW各剂量组SOD活性升高,MDA含量降低,说明LW具有一定抗氧化、减少自由基产生、减轻肝组织过氧化损伤的作用。GSH是生物体内重要的还原性物质,可作为GSH等的辅酶而参与自由基的清除,同时,GSH也具有直接清除自由基的作用,与模型组比较,LW能升高GSH的含量,表明LW可能通过增加GSH的含量而清除自由基,达到保护肝脏的作用。肝组织病理学结果显示,LW高、中剂量组与模型组比较,肝小叶结构清晰、形态完整,肝细胞变性、坏死较轻,这表明 LW对肝脏可起到较好的保护作用。

图1 6组肝组织病理学检查结果A.正常组;B.模型组;C.阳性对照组;D.LW低剂量组;E.LW中剂量组;F.LW高剂量组Fig.1 The histopathology of hepatic tissure of the 6 groupsA.normal group;B.model group;C.possitive control group;D.low-dose LW group;E.middle-dose LW group;F.high-dose LW group

总之,实验结果表明,LW可通过增强机体抗氧化能力,加速自由基清除,修复受损肝细胞,从而达到对ANIT所造成肝损伤的保护作用,使肝功能得到改善。

[1] 徐雪钰,于珊,胡克章,等.灵五颗粒对D-半乳糖胺盐酸盐致小鼠肝损伤的保护作用[J].解放军药学学报,2010,26(5):426-427.

[2] 方厚华.医学实验动物模型[M].北京:军事医学科学院出版社,2001:325.

[3] 黄正明,杨新波,曹文斌,等.水芹退黄降酶疗效的实验研究[J].中国药学杂志,1989,24(2):84-85.

[4] JEAN P A,ROTH R A.Naphthylisothiocyanate disposition in bile and its relationship to liver glutathione and toxicity[J].Biochem Pharmacol,1995,50(9):1469-1474.

[5] DAHM L J,SCHULTZE A E,ROTH R A.An antibody to neutrophils attenuates alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury[J].J Pharmacol Exp Ther,1991,256:412-420.

[6] 杨新波,黄正明,曹文斌,等.CCl4、D-Gal、ANIT 对化学性肝损伤小鼠血清生化指标的影响[J].世界华人消化杂志,1998,6(1):19.

[7] 黄正明,杨新波,曹文斌,等.化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究[J].解放军药学学报,2005,21(1):42-46.

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