王 蕾，舒 旭，伍世挥，吴和平，舒筱灿，罗 海

(怀化医学高等专科学校基础医学部，湖南怀化 418000)

动脉粥样硬化严重危害人类健康;机体处于氧化应激状态，自由基增加导致血管内皮细胞损伤，是动脉粥样硬化形成的危险因素［1］。体内有多种酶参与ROS生成，目前NADPH氧化酶被认为是血管内生成ROS的主要酶体，它是由多个亚基组成的酶复合体，主要包括5个亚组分，其中 gp91phox和p22phox为胞膜组分，p47phox、p67phox及 Rac为胞质组分［2］。已发现的 gp91phox同工酶家族有NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5 等成员［2-4］，内皮细胞主要表达 NOX4和NOX2。

他汀类药物现已成为降胆固醇的首选药物。近年研究提示，他汀类药物除降血脂的作用外，还有其他非降脂作用。为了探讨他汀类药物抗氧化机制，本研究用辛伐他汀(simvastatin)处理脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，观察NADPH氧化酶各亚基表达及ROS生成的变化，为探寻动脉粥样硬化氧化应激损伤的干预措施提供新线索。

1 材料与方法

1.1主要材料M199培养基、HEPES、明胶和Trizol为Gibco产品，逆转录试剂盒为 PROMEGA产品，细胞内ROS检测试剂盒购自江苏碧云天公司，胎牛血清为HYCLONE产品。

1.2方法

1.2.1HUVEC分离培养用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养HUVEC，免疫荧光法检测Ⅷ因子进行鉴定。1.2.2细胞处理不同浓度辛伐他汀分组:①不加辛伐他汀对照组;②10-10mol·L-1辛伐他汀处理2 h组;③10-9mol·L-1辛伐他汀处理2 h组;④10-8mol·L-1辛伐他汀处理2 h组。辛伐他汀不同处理时间组:①不加辛伐他汀对照组;②10-8mol·L-1辛伐他汀处理0.5 h组;③10-8mol·L-1辛伐他汀处理1 h组;④10-8mol·L-1辛伐他汀处理2 h组。

1.2.3逆转录聚合酶链反应检测内皮细胞内NADPH氧化酶各亚基表达用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA;逆转录反应按照PROMEGA公司试剂盒的实验程序完成;PCR引物序列见Tab 1。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳;电泳条带采用Pharmacia Biotech凝胶成像系统分析。

Tab1 Sequence of primer

1.2.4细胞内ROS的检测以DCFH-DA为探针对细胞内ROS进行荧光标记，未加DCFH-DA为阴性对照组，阳性对照组加阳性药物(试剂盒提供)5 μl，未加辛伐他汀处理为对照组，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5实验结果的统计学处理所有数据均用±s表示，用SPSS10.0进行统计处理，统计学采用t检验。

2 结果

2.1HUVECⅧ因子鉴定结果细胞内可见绿色荧光，而未加一抗(用PBS代替一抗)的阴性对照组细胞内未见荧光，证实分离得到的细胞是内皮细胞。

Fig 1 Expression of factorⅧin HUVEC detected by immunofluorescence

2.2NADPH氧化酶各亚基表达对辛伐他汀浓度依赖性应用不同浓度辛伐他汀(10-10，10-9，10-8mol·L-1)处理 HUVEC 2 h，用 RT-PCR分析NADPH氧化酶各亚基表达对辛伐他汀的浓度依赖性。RT-PCR结果显示:与不加辛伐他汀的对照组相比，不同浓度辛伐他汀处理 HUVEC 2 h后，NOX4、p22phox mRNA表达明显下调(P＜0.05，n=3);10-8mol·L-1辛伐他汀处理2 h后p67phox mRNA表达明显下调(P＜0.05，n=3)而 10-10，10-9mol·L-1辛伐他汀处理2 h后p67phox mRNA表达无明显变化;NOX2、RAC mRNA表达无变化。

2.3NADPH氧化酶各亚基表达对辛伐他汀时间依赖性为了进一步确定NADPH氧化酶各亚基表达对辛伐他汀时间依赖性，我们用10-8mol·L-1辛伐他汀分别处理HUVEC 0.5、1和2 h。RT-PCR结果显示:与不加辛伐他汀的对照组相比，辛伐他汀处理0.5 h后 HUVEC中 p67phox、p22phox mRNA 表达明显下调(P＜0.05，n=3);辛伐他汀处理2 h后HUVEC中NOX4 mRNA表达明显下调(P＜0.05，n=3)而辛伐他汀处理0.5 h、1 h NOX4 mRNA表达无明显变化;NOX2、RAC mRNA表达无变化。

2.4辛伐他汀对内皮细胞内ROS生成的影响为了观察辛伐他汀在下调NADPH氧化酶各亚基表达的同时是否也降低ROS生成量，我们以DCFH-DA为荧光探针用流式细胞仪检测HUVEC内ROS水平。结果显示，与不加辛伐他汀的对照组(67.6±3.2)相比，10-8mol·L-1辛伐他汀处理2 h后 HUVEC中 ROS(28.1±2.1)降低(P＜0.05，n=3)。

Fig 2 Effects of different concentration of simvastatin on mRNA expression of NADPH oxidase in HUVEC

3 讨论

他汀类药物现已成为降胆固醇的首选药物，其作用机制是通过选择性阻断HMG-CoA还原酶结合位点，影响胆固醇的生物合成，加速LDL的降解，从而有效地降低血脂。近年研究发现，他汀类药物除了调脂作用外，还存在其他作用如保护内皮祖细胞［6］，抑制心肌肥厚、改善心功能［7］，促进斑块稳定，抑制平滑肌细胞增殖与迁移以及抑制LDL的氧化修饰等。Suh等［3］研究发现他汀可能通过抑制Rac GTP酶活性及其易位而抑制血管平滑肌细胞NADPH氧化酶的激活，从而降低由AngⅡ或EGFR诱发活性氧的生成。Wassmann等［5］在细胞实验中证明阿托伐他汀能下调血管平滑肌细胞NOX1的表达且阻断Rac从胞质到胞膜的易位，从而减少ROS的生成;而动物实验中阿托伐他汀能下调血管平滑肌细胞NOX1和p22phox的表达。本研究表明辛伐他汀处理内皮细胞2 h后 NOX4、p67phox、p22phox mRNA表达明显下调且活性氧生成明显减少，由此我们推测辛伐他汀可能通过下调NADPH氧化酶的各亚组分表达来减少活性氧的生成，从而发挥抗氧化作用。

Fig 3 Effects of simvastatin for different time on mRNA expression of NADPH oxidase in HUVEC

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