张长城， 姜美杰， 赵海霞， 王洪武， 贾亮亮， 何毓敏， 袁 丁

（三峡大学医学院，湖北宜昌 443002）

竹节参总皂苷对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影响

张长城， 姜美杰， 赵海霞， 王洪武， 贾亮亮， 何毓敏， 袁 丁*

（三峡大学医学院，湖北宜昌 443002）

目的 研究竹节参总皂苷（Total Saponins of Panax japonicus Rhizoma，TSPJ）对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠免疫功能的影响。方法 腹腔注射环磷酰胺（Cy）复制免疫功能低下的动物模型；摘取脾脏称质量并计算脾脏指数，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性，微量分光光度法检测血清溶血素抗体HC50形成水平，流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群（CD4+T细胞、CD8+T细胞）比例、B细胞及NK细胞比例，ELISA法检测血清IFN-γ量。结果 TSPJ可增加免疫低下小鼠脾脏质量与脾脏指数，促进脾脏T淋巴细胞增殖，提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，上调外周血CD4+/CD8+比例、B淋巴细胞及NK细胞比例，提高血清中IFN-γ的水平。结论 TSPJ通过刺激小鼠的特异性及非特异性免疫应答，对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能有良好的增强作用。

总皂苷；竹节参；体液免疫；细胞免疫；环磷酰胺

当前，随着社会发展节奏加快，免疫低下已成为导致亚健康状态、肿瘤、感染性疾病的重要原因之一。世界卫生组织（WHO）近年的一项全球性调查表明，处于亚健康状态的人口大约占总人口的35%～50%左右［1］，因此寻找具有良好免疫调节作用的药物已成为目前药物研究的重点之一。

竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicusC.A.Meyer的干燥根茎，1977年以后各版《中国药典》均予收载，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功效。近期研究亦显示，竹节参主要含皂苷、多糖等化学成分［2］，其提取物具有增强机体免疫功能的药理作用，但其免疫调节作用的物质基础与作用机制仍不明确［3］。本研究采用环磷酰胺 （Cyclophosphamide，Cy）腹腔注射制备小鼠免疫低下模型，探讨竹节参总皂苷的免疫调节作用，为竹节参的应用提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 竹节参购自湖北省恩施土家族自治州，经我校中药教研室谭复成教授鉴定为五加科植物竹节参Panax japonicusC.A.Meyer的干燥根茎。竹节参总皂苷由本实验室制备：取干燥竹节参根茎，粉碎后经甲醇冷浸、回流提取，用含水的石油醚萃取多次除去脂质；然后用水饱和正丁醇萃取多次，回流蒸干正丁醇得竹节参总皂苷，经香草醛-高氯酸方法检测皂苷质量分数为25.1%。香菇多糖片（批号10090101），开封制药（集团）有限公司，注射用环磷酰胺（批号07112821），江苏恒瑞医药股份有限公司，RPM-1640，GIBCO公司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所；鸡红细胞，按常规方法制备鸡红细胞悬液；IFN-γ酶免试剂盒，美国Rndsystems公司；Anti CD3/FITC，Anti CD4/PE，Anti CD8/PE，Anti CD49b/PE，AntiCD19/PE，美国 e-Bioscience公司产品。其余试剂均为分析纯。

1.2 动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，由湖北省动物实验研究中心提供，合格证号：SCXK（鄂2008-0005）。豚鼠：健康豚鼠。鸡：健康家鸡。

1.3 仪器 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TYPE1500-458型酶标仪，美国；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；CO2细胞培养箱，美国Shell/LAB公司；CKX41型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；Suprafuge 22型离心机，德国Heraeus公司；COULTZER EPICS XL2MCL型流式细胞仪，美国Beckman-Coulter公司。

2 方法

2.1 Cy诱导免疫低下小鼠模型的制备与分组 取昆明种小鼠（18～22 g），48只，随机分为空白对照组，模型组，阳性对照组（香菇多糖100 mg/kg）；竹节参皂苷（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）组，分别灌胃给药，连续7 d，对照组及模型组给予相应体积的蒸馏水。第3天除对照组外腹腔注射Cy 50 mg/kg，对照组给予等容量生理盐水腹腔注射，每天1次，连续注射3 d，制备免疫功能低下的动物模型。

2.2 小鼠脾脏指数的测定 给药完成后，记录小鼠体质量，颈椎脱臼处死，取脾并称湿质量，以小鼠脾质量/体质量（mg/g）作为脾脏指数。

2.3 脾淋巴细胞增殖实验［4］无菌取脾，常规制备脾细胞悬液（1×1010/L），在96孔培养板上，每孔加入100 μL脾细胞悬液（终浓度5×109/L），100 μL亚适浓度ConA（5 mg/L），终容积为200 μL，各设3个复孔，置37℃、5%CO2培养箱培养48 h，培养终止前4 h，再加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h。取出96孔培养板，2 000 r/min，离心10 min，吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，充分振荡溶解甲臜颗粒，于30 min内用酶标仪在570 nm测量吸光度值。计算刺激指数（SI）。

SI=Con A刺激孔A均值/对照孔A均值

2.4 血清溶血素的测定［3］取昆明种小鼠（18～22 g），48只，分组同上。灌胃给药，连续7 d。第3天每鼠腹腔注射20%的鸡红细胞0.2 mL致敏。同时除对照组外每只小鼠腹腔注射Cy50 mg/kg（对照组给予等容量生理盐水）。致敏后5 d，摘除眼球取血，按常规方法取得血清，血清稀释100倍，鸡红细胞稀释20倍，按微量分光光度法操作［2］，用酶标仪在450 nm测定吸光度值。按下列公式计算每只小鼠样品的半数溶血值（HC50）。

2.5 T淋巴细胞亚群，B淋巴细胞以及NK细胞比例的测定 于小鼠末次灌胃给药24 h后，眼球取血，每个样品加入50 U/mL的肝素抗凝，分别加入FITC标记的CD3和PE标记的CD4抗体各1 μg（检测CD4亚群T细胞），或者加入FITC标记的CD3和PE标记的CD8抗体各1 μg（检测CD8亚群T细胞），或者加入PE 标记的CD49b抗体0.5 μg（检测NK细胞），或者加入PE标记的CD19抗体 0.5 μg（检测B细胞），混匀，4℃孵育30 min，然后把试管放入Q-PreP标本制备仪上进行自动溶血，加入固定液；1 500 r/min离心5 min，弃上清，清洗2次，加入600 μL PBS振荡混匀，避光保存于4℃冰箱待上机检测。流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞、B细胞以及NK细胞比例。

2.6 血清中IFN-γ细胞因子水平的测定 小鼠末次给药后，摘小鼠眼球取血，分离血清，采用ELIAS法检测，按试剂盒操作说明进行。

3 结果

3.1 TSPJ对免疫低下小鼠脾脏指数的影响 模型组小鼠脾脏指数比空白对照组降低，TSPJ（200、400 mg/kg）剂量组可以显著提高模型小鼠脾指数，见表1。

表1 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠脾脏指数的影响（±s，n=8）Tab.1 Effect of TSPJ on splenic index in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表1 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠脾脏指数的影响（±s，n=8）Tab.1 Effect of TSPJ on splenic index in immunnodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg） 脾脏指数/（mg/g）3.36 ±0.33模型组 - 2.03 ±0.23△△香菇多糖组 100 3.00 ±0.16＊＊TSPJ低剂量 100 2.17 ±0.37 TSPJ中剂量 200 2.50 ±0.47*TSPJ高剂量 400 2.56 ±0.22空白对照组-*

3.2 TSPJ对免疫低下小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠T淋巴细胞增殖反应受到明显抑制；TSPJ各剂量组对Cy致免疫低下小鼠T淋巴细胞增殖均有显著性提高，见表2。

表2 TSPJ对免疫低下小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响（±s，n=8）Tab.2 Effect of TSPJ on proliferation of T lymphocytes in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表2 TSPJ对免疫低下小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响（±s，n=8）Tab.2 Effect of TSPJ on proliferation of T lymphocytes in immunnodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg）1.48 ±0.45模型组 - 1.03 ±0.24△香菇多糖组 100 1.74 ±0.25*TSPJ低剂量 100 1.61 ±0.11*TSPJ中剂量 200 2.58 ±0.10＊＊TSPJ高剂量 400 3.01 ±0.18空白对照组-＊＊SI

3.3 TSPJ对免疫低下小鼠血清溶血素的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠HC50明显降低；TSPJ中、高剂量组对Cy致免疫低下小鼠HC50有显著性提高，提示TSPJ对小鼠特异性体液免疫反应有促进作用，见表3。

表3 TSPJ对免疫低下小鼠血清溶血素的影响（±s，n=8）Tab.3 Effect of TSPJ on serum hemolysin in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表3 TSPJ对免疫低下小鼠血清溶血素的影响（±s，n=8）Tab.3 Effect of TSPJ on serum hemolysin in immunnodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg） HC50 104.54 ±4.527模型组 - 33.32 ±1.892△△香菇多糖组 100 84.36 ±1.492＊＊TSPJ低剂量 100 35.00 ±2.647 TSPJ中剂量 200 47.15 ±4.117*TSPJ高剂量 400 53.08 ±3.288空白对照组-＊＊

3.4 TSPJ对免疫低下小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 模型组小鼠T淋巴细胞亚群比例失调，CD4+/CD8+比值下降，显著低于正常对照组；TSPJ各剂量组均可明显提高CD4+/CD8+比值，结果见表4。

3.5 TSPJ对免疫低下小鼠B淋巴细胞和NK细胞的影响 与对照组比较，模型组小鼠外周血B淋巴细胞比例明显降低；TSPJ各剂量组对Cy致免疫低下小鼠NK细胞、B细胞比例均有显著性提高。结果见表5。

3.6 TSPJ对免疫低下小鼠IFN-γ水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清IFN-γ量明显降低；TSPJ各剂量组均具有显著性提高。结果见表6。

表4 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响Tab.4 Effect of TSPJ on T lymphocyte subsets in immunodepressed mice（±s，n=8）

表4 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响Tab.4 Effect of TSPJ on T lymphocyte subsets in immunodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group；*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg） CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+空白对照组 - 78.42 ±2.90 57.81 ±1.84 19.63 ±2.00 2.96 ±0.17模型组 - 72.44 ±12.25 51.38 ±13.06 22.04 ±6.19 2.34 ±0.06△△香菇多糖组 100 67.88 ±10.14 56.12 ±3.54 12.63 ±5.59 4.91 ±1.79＊＊TSPJ低剂量 100 86.02 ±2.92 65.44 ±1.98 21.65 ±1.73 3.03 ±0.12*TSPJ中剂量 200 88.54 ±2.93 71.86 ±0.56 17.38 ±0.89 4.14 ±0.15＊＊TSPJ高剂量 400 72.72 ±5.897 58.82 ±4.45 13.08 ±4.16 4.69 ±1.01＊＊

表5 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠NK细胞、B淋巴细胞的影响Tab.5 Effect of TSPJ on NK cells and B cells in immunodepressed mice（±s，n=8）

表5 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠NK细胞、B淋巴细胞的影响Tab.5 Effect of TSPJ on NK cells and B cells in immunodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group；*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg） NK cell/% B cell/%- 12.61 ±2.17 7.60 ±1.91模型组 - 2.31 ±1.07△△ 1.81 ±1.29△香菇多糖组 100 17.64 ±3.67＊＊ 12.75 ±9.37＊＊TSPJ低剂量 100 9.30±1.67＊＊ 4.95±2.71*TSPJ中剂量 200 10.81±1.19＊＊ 7.64±0.15＊＊TSPJ高剂量 400 13.30±1.67＊＊ 9.12±1.89空白对照组＊＊

表6 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠外周血中IFN-γ水平的影响 （±s，n=8）Tab.6 Effect of TSPJ on IFN-γ in immunodepressed mice（±s，n=8）

表6 竹节参总皂苷对免疫低下小鼠外周血中IFN-γ水平的影响 （±s，n=8）Tab.6 Effect of TSPJ on IFN-γ in immunodepressed mice（±s，n=8）

与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量/（mg/kg） IFN-γ/（pg/mL）17.19 ±0.56模型组 - 14.02 ±0.63△△香菇多糖组 100 16.68 ±0.34＊＊TSPJ低剂量 100 15.67 ±0.83*TSPJ中剂量 200 16.25 ±0.44＊＊TSPJ高剂量 400 16.29 ±0.34空白对照组-＊＊

4 讨论

环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，亦是一种强免疫抑制剂［6］。其主要免疫抑制机制为：可杀伤淋巴细胞，尤其是早期对B细胞、NK细胞作用明显；抑制T淋巴细胞对抗原刺激后的淋巴母细胞转化；抑制B细胞的特异性抗体反应［7］。本实验采用Cy成功诱导免疫低下小鼠模型，结果显示其脾脏指数降低、特异性抗体生成减少、淋巴细胞增殖能力下降和外周血淋巴细胞比例紊乱。

脾脏是机体最大的免疫器官，拥有全身循环T淋巴细胞的25%，直接参与细胞免疫［8］。T淋巴细胞作为免疫效应细胞和免疫调节细胞，根据功能可分为辅助性T细胞（TH）、抑制性T细胞（TS）和细胞毒性 T细胞（CTL），其中 TH（CD4+）细胞与 TS（CD8+）细胞的相互协调是维持免疫平衡重要环节，在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用［9］。本研究结果显示，TSPJ能明显提高脾脏指数，能明显促进脾脏T淋巴细胞增殖反应，同时上调外周血CD4+/CD8+细胞比值，提示TSPJ能够增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能。

环磷酰胺对外周血B细胞有强烈的抑制作用［10］，本实验显示TSPJ能够拮抗环磷酰胺对B细胞的强抑制性，使外周血B细胞比例得到一定程度恢复；另一方面，TSPJ能显著增加免疫抑制小鼠的血清溶血素量，提示免疫低下小鼠的体液免疫功能得到较好的保护。NK细胞被认为是机体天然免疫的第一道防线，发挥连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁作用［11］。本研究发现，环磷酰胺对外周血NK细胞亦有强烈的抑制作用，免疫低下小鼠的外周血NK细胞几乎消失，TSPJ可以使之恢复到正常水平说明TSPJ对小鼠天然免疫系统具有较好恢复作用。IFN-γ是机体最重要的免疫调节因子之一，其诱导免疫细胞表达多种细胞因子，调节细胞因子平衡，进一步扩大免疫应答［12］。本实验结果显示TSPJ可提高外周血IFN-γ水平，提示TSPJ可通过促进细胞因子IFN-γ的分泌来增强小鼠的整体免疫功能。

本研究结果提示，TSPJ对免疫抑制小鼠细胞免疫功能和体液免疫功能有保护作用，并可增强体内IFN-γ水平，提示TSPJ可能是竹节参提高机体免疫功能的主要物质，而增强IFN-γ水平可能为其作用机制之一，但由于中药成分复杂，体内作用靶点多，因而其调节免疫功能的物质基础和分子机制仍有待进一步研究。

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Effects of total saponins of Panax japonicus Rhizoma on cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice

ZHANG Chang-cheng， JIANG Mei-jie， ZHAO Hai-xia， WANG Hong-wu， JIA Liang-liang， HE Yu-min，
YUAN Ding

（Medical College of China Three Gorges University，Yichang 443002，China）

AIMTo investigate the immunomodulatory effects of total saponins ofPanax japonicus Rhizoma（TSPJ）on cyclophosphamide（Cy）-induced immunosuppressed mice.METHODSIn this study，immunosuppressed murine models were established in Kunming mice induced by Cy，the splenic indexes were evaluated，the percentage of CD4+，CD8+T cells，B cells，NK cells and ratios of CD4+/CD8+in peripheral blood were analysed by flow cytometry（FCM）.IFN-γ serum levels were detected by ELISA.Activity of splenic lymphocyte proliferation was assayed by MTT and levels of serum hemolysin were confirmed by spectrophotometry.RESULTS

TSPJ evidently increased splenic index，improved the percentage of peripheral B cells，NK cells and ratios of CD4+/CD8+，raised serum levels of IFN-γ，and promoted the proliferation of splenic lymphocytes and the produc-tion of serum hemolysin.CONCLUSIONTSPJ shows significant immunomodulatory property on immunosuppressive mice through specific and nonspecific immunity.

total saponins；Panax japonicus Rhizoma；humoral immunity；cellular immunity；cyclophosphamide

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1134-05

2010-11-12

国家自然科学基金项目（30873383）

张长城 （1973—），医学博士，副教授，主要从事中药药理学研究。Tel：（0717）6396558，E-mail：greatwall@ctgu.edu.cn

*通信作者：袁 丁（1964—），医学博士，教授。Tel：（0717）6397366，E-mail：yxyyd@ctgu.edu.cn