HPLC法测定瑞香狼毒中香豆素类三种成分含量

2011-05-26郭晏华

中成药 2011年3期

胡爽，郭晏华

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600)

瑞香狼毒为瑞香科植物瑞香狼毒Stellera chamejasmeL.的干燥根，又名断肠草、红狼毒、山萝卜等。其味辛，性平，有一定毒性。入肺、脾、肝经。具有逐水、破积、祛痰、杀虫、止痛的功能［1］。广泛分布于我国西北、西南、东北及河北等地，资源十分丰富［2］。其主要化学成分有黄酮类、香豆素类、二萜类、三萜类、木脂素类和苯丙烯酸醇苷类等［3-5］。其中香豆素类化合物是瑞香科植物的特征性成分，且大多具有较强生物活性，在瑞香狼毒根中的含量高达 0.355%［6］。目前，关于瑞香狼毒的文献报道多是毒理、药理和化学成分的研究［7-10］，有关于其含量测定方面的文献报道较少。本实验同时测定了瑞香狼毒药材中3种指标性成分的含量，之前尚未见相关文献报道，且该方法快捷、准确，可作为瑞香狼毒药材质量控制的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线脱气机、VWD检测器;METTLER AB135-S十万分之一电子天平(瑞士);SHIMADZU AY220型电子分析天平;U-3010型紫外-可见分光光度计;HH-4数显恒温水浴锅。

1.2 试药瑞香素对照品由成都普思生物科技有限公司提供，伞形花内酯对照品(批号:111739-200501)，东莨菪内酯对照品(批号:110768-200504)均购于中国药品生物制品检定所。本研究收集了10个不同来源的瑞香狼毒药材，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定均为正品药材。乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:AgiLent EcLipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-1%冰乙酸(B)，梯度洗脱;检测波长:327 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL。见表 1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备精密称取瑞香素，伞形花内酯，东莨菪内酯对照品适量，分别置于10 mL棕色量瓶中加甲醇溶解，制得浓度分别为0.221 mg/mL、0.304 mg/mL、0.262 mg/mL的对照品贮备液，备用。精密吸取瑞香素对照品贮备液0.5 mL，伞形花内酯对照品贮备液5 mL，东莨菪内酯对照品贮备液0.3 mL置同一棕色10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得对照品混合液。

2.3 供试品溶液的制备精密称取瑞香狼毒药材(过60目筛)约3.0 g，加入95%乙醇50 mL，加热回流3次每次1 h，过滤，浓缩。用95%乙醇定容至10 mL的量瓶中，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，备用。

2.4 系统适用性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，在选定的色谱条件下瑞香素，伞形花内酯和东莨菪内酯的理论塔板数均不少于10 000，与其他峰的分离度均大于1.5。见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备精密吸取2.2项下的混合对照品溶液 2、4、6、10、15、20 μL 注入高效液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得瑞香素回归方程为:Y=143X－96.973，r=0.999 7;伞形花内酯回归方程为:Y=2 095X－1 235.3，r=0.999 6;东莨菪内酯回归方程为:Y=109.6X－89.44，r=0.999 6;结果表明，各对照品在各自的线性范围内呈良好的线性关系。

图1 混合对照品(A)和样品(B)HPLC谱图

2.5.2 精密度试验精密吸取同一供试品溶液(7号内蒙古)连续进样6次，记录色谱峰面积，结果瑞香素、伞形花内酯和东莨菪内酯峰面积的RSD值分别为0.4%、0.7%和0.3%。结果表明，本试验仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(7号内蒙古)在 0、2、4、8、12、24 h 分别进样分析，记录色谱峰面积，结果瑞香素，伞形花内酯和东莨菪内酯峰面积的RSD值分别为1.7%、1.8%和2.0%。结果表明，供试品溶液在室温状态下24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验取同一批瑞香狼毒药材(7号内蒙古)样品6份，按2.3项方法制备供试品溶液，并进样分析，记录色谱峰面积，结果瑞香素、伞形花内酯和东莨菪内酯峰面积的RSD值分别为2.3%、2.2%和2.1%。结果表明，本方法重复性较好。

2.5.5 回收率试验取已知含量的药材(7号内蒙古)6份，每份约1.5 g(瑞香素含量0.034 4 mg/g，伞形花内酯含量0.471 7 mg/g，东莨菪内酯含量0.026 1 mg/g)精密称定，置圆底烧瓶中，每份精密加入瑞香素对照品2.5 mL(浓度为0.022 1 mg/mL)、伞形花内酯2.5 mL(浓度为0.304 mg/mL)和东莨菪内酯1.6 mL(浓度为0.026 2 mg/mL)，按2.3项方法制备供试品溶液，测定，结果见表2～4。

2.6 瑞香狼毒药材中瑞香素，伞形花内酯和东莨菪内酯的含量测定取不同来源的瑞香狼毒药材粉末(过60目筛)各约3.0 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取各溶液10 μL，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪进行分析，记录峰面积并计算瑞香素、伞形花内酯和东莨菪内酯的含量，结果见表5。

表2 瑞香素加样回收试验结果(n=6)

表3 伞形花内酯加样回收试验结果(n=6)

表4 东莨菪内酯加样回收试验结果(n=6)

表5 样品测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 从表5可以看出10个不同来源的瑞香狼毒药材3种指标性成分含量差别很大，其中伞形花内酯的含量最高，从0.364 4～0.923 7 mg/g;东莨菪内酯的含量次之，从0.012 0～0.034 6 mg/g;瑞香素的含量最低，从0.008 4～0.034 4 mg/g。根据文献报道，瑞香素具有抗血栓、降脂、镇痛、抗炎、提高免疫，抗菌等多种作用［11］。伞形花内酯、东莨菪内酯均具有抑菌，抗癌的作用。因此对瑞香狼毒中该3种成分进行含量测定，对其质量控制具有重要的意义。

3.2 检测波长的选择根据紫外吸收光谱特征，瑞香素、伞形花内酯皆在327 nm有最大吸收［12-13］，东莨菪内酯在340 nm有最大吸收［14］。由于东莨菪内酯在327 nm和347 nm的紫外吸收光谱图差异较小，为兼顾3种成分在同一色谱图上有最大吸收，最终选择检测波长为327 nm。

3.3 流动相系统的选择分别以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1%冰乙酸和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同浓度和比例的流动相系统进行梯度洗脱实验，通过比较不同流动相系统的色谱图，为使谱图上待测成分的分离度较好，最终确定以乙腈(A)-1%冰乙酸(B)为流动相进行梯度洗脱。

3.4 提取条件的选择本实验通过单因素考察，比较了超声提取法、加热回流提取法和索氏提取法的提取效果，并同时比较了不同溶剂甲醇和乙醇的提取效果，并通过正交设计实验考察了提取时间、提取次数、醇浓度和溶剂用量对提取效果的影响。最终选定以95%乙醇、50 mL、加热回流3次每次1 h提取效果最好。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.下册.上海:上海人民出版社，1997.

［2］赵奎君，徐国钧，金蓉鸾，等.狼毒类专题研究常用中药材品种整理和质量研究［M］.南方协助组第二册，福州:福建科学技术出版社，1997，7(1):184-187.

［3］卓兆莲，高英，李卫民.蒙药瑞香狼毒化学成分研究进展［J］.中国药房，2007，18(27):2152-2153.

［4］张慧文，鞠爱华，周秀娟.瑞香狼毒化学成分与生物活性研究进展［J］.中药材，2006，29(11):1257-1261.

［5］裴月湖，冯宝民，华会明，等.瑞香狼毒化学及药理研究进展［J］.中草药，2001，32(8):764-766.

［6］郑宝江，胡海清.松嫩草地瑞香狼毒香豆素类化合物含量动态变化［J］.黑龙江大学自然科学学报，2006，23(2):223-226.

［7］卓兆莲，高英，李卫民.蒙药瑞香狼毒的生物活性及毒副作用研究［J］.中国现代中药，2007，9(12):32-34.

［8］金贤兰.中药狼毒的药理作用及临床应用［J］.现代医药卫生，2008，24(20):3101-3102.

［9］刘欣，叶文才，车镇涛，等.瑞香狼毒的化学成分研究［J］.中草药，2004，35(4):379-381.