许文集，庄瑛瑛，陈玉丽，庄则豪，王承党

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，一般认为其发生是一个多因素参与、多阶段演进的过程。目前认为，慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是胃腺癌 (gastric adenocarcinoma，GAC)的癌前期状态，肠上皮化生 (intestinal metaplasia，IM)和异型增生 (dysplasia，Dys)是GAC重要的癌前期病变。然而，其确切的发生机制尚未阐明。Paxillin是一种黏着斑相关蛋白，主要存在于黏着斑，而黏着斑是细胞与细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的接触点，构成ECM与细胞骨架联系的纽带，也是信号转导的主要部位，促进信号从胞外基质经整合素途径向细胞内传递［1］。多项研究已表明Paxillin有参与动态调节黏着斑、调节细胞移动和播散等功能［2－3］，阳性表达与肿瘤的侵袭、转移相关［4］，改变Paxillin的磷酸化状态，足以关键性地调控细胞的迁移［5］。

本研究通过应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶 (S－P)染色方法检测Paxillin在GAC及癌前期变化(CAG、IM、Dys)组织中的表达情况，并以慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)组织作为对照，探讨Paxillin在GAC发生、发展中的作用以及其与GAC病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 病例来源

1.1.1 GAC组 选自福建医科大学附属第一医院2005年6—12月间经手术切除、病理确诊、剔除术前接受过化疗或放疗的GAC组织标本59例，其中男50例，女9例;年龄37～81岁。按世界卫生组织 (WHO)肿瘤病理学与遗传学分类GAC的组织学分型标准，高分化GAC 9例，中分化GAC 25例，低分化GAC 25例;早期GAC 9例，进展期GAC 50例;无淋巴结转移30例，伴淋巴结转移29例。

1.1.2 CSG组及癌前期变化组 连续选取本院同期胃镜下活检且经病理确诊的组织标本，轻度CSG 30例，其中男14例，女16例;年龄21～68岁。中度CAG 30例，其中男19例，女11例;年龄21～73岁。中重度IM 30例，其中男14例，女16例;年龄24～68岁。中重度Dys20例，其中男17例，女3例;年龄32～77岁。

1.2 试剂 鼠抗人Paxillin单克隆抗体 (产品编号:Clone 5H11):NeoMarkers产品，工作浓度1∶200。免疫组化染色超敏试剂盒 (产品编号:LHK611抗小鼠)(含S－P免疫组化染色试剂与DAB显色剂)，购自深圳晶美生物工程有限公司。磷酸盐缓冲液 (PBS缓冲液，0.01 mol/L，pH=7.4)和枸橼酸盐缓冲液 (Citrate抗原修复液，0.01 mol/L，pH=6.0)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用双蒸水配制。

1.3 实验方法 所有标本经常规甲醛固定，石蜡包埋，制成4μm连续切片，贴于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，60℃烤箱过夜，保存于4℃冰箱中。采用免疫组织化学S－P染色方法检测Paxillin，操作按说明书进行。阳性对照分别由购买相应抗体的试剂公司提供，同时用PBS替代第一抗体作阴性对照。采用OLYMPUS BH－2光学显微镜 (OLYMPUS Co.)、Motic图像分析仪 (北京麦克奥迪图像技术有限公司)观察并摄片。

1.4 实验结果判断与图像分析 光镜下双盲阅片，独立观察每张切片5个具有代表性的高倍视野，每个视野计数200个细胞。具体判断标准如下:Paxillin定位于细胞质和 (或)细胞膜，以细胞质和 (或)细胞膜出现棕黄色染色为阳性信号。(1)根据染色程度进行评分:染色强度弱者 (淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色)为1分，染色强度强者 (呈黄至棕黄色染色)为3分，染色强度中等者 (染色强度介于弱者和强者之间)为2分;(2)根据着色细胞百分率进行评分:着色细胞占计数细胞百分率＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分。将每张切片染色强度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，为其最后得分。得0～1分为阴性 (－)，得2～3分为弱阳性 (+)，得4～5分为中等阳性 (++)，≥6分为强阳性 (+++)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件包进行统计学处理，采用非参数检验及等级资料Spearman秩相关分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Paxillin在腺癌细胞胞质均呈弥漫性中等至强阳性染色，CSG细胞仅胞膜淡染，与CSG组相比，CAG组、IM组、Dys组及GAC组中Paxillin表达均有不同程度的增强，差异有统计学意义 (p＜0.05);与GAC组相比，CAG组、IM组及Dys组中Paxillin表达均较低，差异有统计学意义 (p＜0.05);而IM组与Dys组间Paxillin表达差异无统计学意义 (P＞0.05);Paxillin表达程度和胃黏膜病变程度呈正相关 (rs=0.779，P=0.000)，随胃黏膜病变程度的加重，Paxillin表达逐渐增强(见表1，图1～6)。

表1 Paxillin在GAC、癌前期变化及CSG中的表达［n(%)］Table 1 The expression of Paxillin in GAC，preneoplastic changes and CSG groups

图1 CSG细胞膜淡染 (×400)Figure 1 Only light staining was found in CSGcells

图2 CAG细胞膜和细胞质不均匀染色 (×400)Figure2 Asymmetrical staining was found in CAGcells

图3 IM细胞弥漫染色 (×400)Figure3 Moderately staining was found in IM cells

图4 Dys细胞弥漫染色 (×400)Figure 4 Moderately staining was found in Dys cells

图5 高分化GAC细胞弥漫较强染色 (×400)Figur e5 St r ongl yandasyst emat icst ainingwasf oundinwel l－dif f er ent iat edGACcel l s

图6 低分化GAC细胞弥漫强染色 (×400)Figure6 St rongl yandasystemat icst ainingwasf oundinpoor－dif f er entiat edGACcel l s

2.2 进展期及伴淋巴结转移GAC组中Paxillin表达程度高于早期及无淋巴结转移GAC组，差异均有统计学意义 (p＜0.05);高分化、中分化和低分化GAC组间Paxillin表达比较，差异有统计学意义 (p＜0.05)，其中中分化和低分化GAC组间Paxillin表达差异无统计学意义 (P＞0.05)，中、低分化组Paxillin表达高于高分化组，差异有统计学意义 (p＜0.05，见表2)。

表2 Paxillin表达程度与GAC病程的关系［n(%)］Table 2 The expression of Paxillin in different degrees of gastricmucosal lesions

3 讨论

本研究结果显示，Paxillin在CSG组中已有表达，且随着胃黏膜病变程度的加重，表达逐渐增强，在GAC组中表达最强，59例GAC癌细胞胞质均呈弥漫性中等至强阳性着色，正常细胞为胞膜淡染，表明腺癌细胞中Paxillin不仅表达增高，而且在细胞内的分布和传输也发生了改变。由于Paxillin可与病毒癌基因v－Src蛋白、v－Crk蛋白和BCR/ABL癌性融合蛋白等多种致瘤性蛋白结合，扰乱、甚至误导正常黏附和控制细胞增殖所需的生长因子信号级联反应［6］，因此，GAC演化过程中Paxillin的表达异常可能是一种不可忽视的分子事件，其表达上调可能为组织恶性转化的早期标志，且其影响可能持续至GAC阶段。本研究结果显示，中分化和低分化GAC组中Paxillin表达显著高于高分化GAC组，田素芳等［7］在GAC中也观察到同样的结果，表明Paxillin作用持续到GAC阶段，且与GAC的分化有一定的关系，但确切的作用机制尚有待于进一步研究。

本研究结果还发现，进展期和伴淋巴结转移GAC组中Paxillin表达显著高于早期和无淋巴结转移GAC组。研究已发现，在高转移潜能乳腺癌细胞中Paxillin在基因和蛋白水平的表达均高于低转移潜能乳腺癌细胞，高转移潜能乳腺癌细胞的黏附率高于低转移潜能乳腺癌细胞［8］;肝细胞癌患者中Paxillin的阳性率在低分化组高于高分化组，伴有门静脉癌栓形成组高于无癌栓形成组，伴有肝外转移组高于无肝外转移组［9］，与本研究相符，提示癌组织中Paxillin表达升高与GAC的转移有关，可能使GAC细胞运动能力增强，与其周围的非肿瘤细胞之间的局部黏附作用加强，肿瘤细胞更容易发生侵袭和迁移，进而形成转移。

研究表明当Paxillin表达低下或缺失时，细胞形态变圆，影响细胞的扁平及丝状伪足形成，细胞黏附能力下降，在培养基中扩散运动能力下降［10］。该基因缺失的成纤维细胞表现为细胞迁移能力缺陷，表明Paxillin具有控制细胞播散和移动的能力［2］。Paxillin过表达或磷酸化可使SCC25舌磷状细胞癌细胞迁移、黏附能力增强［11］，使无侵袭性的乳腺癌细胞向有侵袭性表型转化［4］。最新体外研究表明，胃癌细胞系的侵袭力与纤维连接蛋白和Paxillin酪氨酸118(tyr118)磷酸化呈正比，通过siRNA沉默Paxillin tyr118磷酸化，纤维连接蛋白刺激的该细胞系侵袭力也受抑制，Paxillin是纤维连接蛋白刺激胃癌细胞系侵袭的重要因子［12］。Chen等［13］发现乳腺肿瘤激酶Brk促进乳腺癌细胞系细胞的迁移和侵袭是Paxillin磷酸化引起的，Paxillin是Brk的结合蛋白和作用底物，EGF激活Brk的催化活性，Brk再磷酸化 Paxillin的 Y31和 Y118，通过适配蛋白(CrkII)激活鸟苷三磷酸酶Rac1(GTPase Rac1)，从而引起细胞侵袭和迁移。其丝氨酸磷酸化也参与细胞移动作用。肝细胞生长因子促进上皮细胞铺展和迁移的过程是通过ERK磷酸化Paxillin的S83实现的［14］。抑制蛋白磷酸酶2A(PP－2A)导致Lewis肺癌细胞系细胞变圆、增加细胞的运动性，这过程中伴随着Paxillin丝氨酸磷酸化增加和酪氨酸磷酸化减少［15］。Petit等［5］认为胶原蛋白诱导的NBT－II膀胱癌细胞的黏附和伸展均与Paxillin的酪氨酸磷酸化有关，如果把其分子中两个最主要的酪氨酸Y31和Y118突变为苯丙氨酸并在细胞中过表达，则可以有效抑制细胞的运动，而细胞附着和铺展并未受到影响。本研究在蛋白水平提示Paxillin可能参与GAC的侵袭和转移，可能是GAC淋巴结转移的预测指标，但具体的作用机制有待于进一步的深入研究。

也有研究显示了不同的结果。大肠癌中Paxillin表达水平显著高于配对的正常黏膜，而和转移癌之间则无明显差异［16］。siRNA阻断黏着斑激酶 (focal adhesion kinase，FAK)和Paxillin的信号途径导致HeLa细胞运动增强［17］。这些现象目前尚无肯定的解释，可能与他们的实验设计、组织存在差异、应用的细胞迁移基质不同等有关，也可能提示肿瘤细胞的转移有比Paxillin更强的影响因素在起作用。Forest等［18］认为，Paxillin的表达和磷酸化水平取决于肿瘤细胞的组织类型。在不同肿瘤中表达和磷酸化不同可能是因为Paxillin在细胞中的作用具有组织和器官特异性。

1 Clark EA，Brugge JS.Integrins and signal transduction pathways:the road taken［J］.Science，1995，268(5208):233－239.

2 Schaller MD.Paxillin:a focal adhesion－associated adaptor protein［J］.Oncogene，2001，20(44):6459 －6472.

3 Iwasaki T，Nakata A，Mukai M，et al.Involvement of phosphorylation of Tyr31and Tyr118of paxillin in MM1 cancer cell migration［J］.Cancer，2002，97(3):330 －335.

4 Vadlamudi R，Adam L，Tseng B，et al.Transcripitional up －regulation of paxillin expression by heregulin in human breast cancer cells［J］.Cancer Res，1999，59(12):2843 －2846.

5 Petit VB，Boyer D，Lentz CE，et al.Phosphorylation of tyrosine residues 31 and 118 on paxillin regulates cell migration through an association with CRK in NBT － II cells［J］.Cell Biol，2000，148(5):957－970.

6 Turner CE.Molecules in focus paxillin ［J］.Cell Biol，1998，30(9):955－959.

7 田素芳，熊永炎，余少平，等.Paxillin在胃腺癌中的表达及临床意义［J］.世界华人消化杂志，2003，11(10):1632－1634.

8 CAI Hui，ZHANG Tao，TANG Wei，et al.Fibronectin promotes tyrosine phosphory－lation of paxillin and cell invasiveness in the gastric cancer cell line AGS ［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，41(1):91－94.

9 Li HG，Xie DR，Shen XM，et al.Clinicopathological significance of expression of paxillin，syndecan－1 and EMMPRIN in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11(10):1445 －1451.

10 Hagel M，George EL，Kim A，et al.The adaptor protein paxillin is essential for normal development in the mouse and is a critical transducer of fibronectin signaling［J］.Mol Cell Biol，2002，22(3):901－915.

11 Conway WC，Vander Voortvan Zyp J，Thamilselvan V，et al.Paxillin modulates squamous cancer cell adhesion and is important in pressure－ augmented adhesion［J］.Cell Biochem，2006，98(6):1507－1516.

12 Li D，Ding J，Wang X，et al.Fibronectin promotes tyrosine phosphoryla－tion of paxillin and cell invasiveness in the gastric cancer cell line AGS ［J］.Tumori，2009，95(6):769－779.

13 Chen HY，Shen CH，Tsai YT，et al.Brk activates rac1 and promotes cell migration and invasion by phosphorylating paxillin ［J］.Mol Cell Biol，2004，24(24):10558 －10572.

14 Ishibe S，Joly D，Liu ZX，et al.Paxillin serves as an ERK －regulated scaffold for coordinating FAK and Rac activation in epithelial morphogenesis［J］.Mol Cell，2004，16(2):257－267.

15 Jackson JL，Young MR.Protein phosphatase－2A modulates the serine and tyrosine phosphorylation of paxillin in Lewis lung carcinoma tumor variants［J］.Clin Exp Metasasis，2002，19(5):409－415.

16 Ayaki M，Komatsu K，Mukai M，et al.Reduced expression of focal adhesion kinase in liver metastases compared with matched primary human colorectal adenocarcinomas ［J］.Clin Cancer Res，2001，7(10):3106－3112.

17 Yano H，Mazaki K，Kurokawa SK，et al.Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin－based cell－cell adhesion［J］.Cell Biol，2004，166(2):283 －295.

18 Forest V，Campos L，Vergnon JM，et al.Characterization of the focal adhesion complex in human non－small cell lung cancer cell lines［J］.Anticancer Res，2005，25(6):4135 －4139.