肖卫华 陈佩杰

1 上海体育学院运动科学学院（上海 200438）

2 湘南学院体育系

巨噬细胞是重要的非特异性免疫细胞，具有趋化、吞噬、杀菌、分泌炎性因子和抗原递呈等多种功能，广泛分布于肝脏、肾脏、肌肉、肺、腹腔和血液等多个组织器官，在机体病菌防御、炎症反应、坏死组织清除和抑制肿瘤等方面具有重要作用[1]。胰岛素样生长因子（IGF-1）可介导生长激素的功能，具有促进蛋白合成、促进细胞增殖等多种功能[2]。研究表明，巨噬细胞可表达IGF-1[3]，且巨噬细胞来源的IGF-1在动脉粥样硬化斑块发展[3，4]、机体炎症反应[5]、肺纤维化[6]、防止肌肉萎缩及促进损伤肌肉的修复[7]等过程中均有重要作用。

IGF-1前体可选择性剪接产生多种异构体，如IGF-1Ea、IGF-1Eb等[8]，IGF-1Ea即为可由机体多个组织器官产生、已被广泛研究的IGF-1。啮齿目动物的IGF-1Eb相比IGF-1Ea插入了52个碱基对的一段序列，导致其羧基端有别于IGF-1Ea，功能和信号途径均不同于 IGF-1Ea[9]，IGF-1Eb 被认为只能在机械应力敏感组织如肌肉中才可检测到，所以又被称为机械生长因子（mechano growth factor，MGF）[8]。MGF 具有不同于 IGF-1 的多种功能，具有激活肌卫星细胞，防止肌肉萎缩，促进肌肉体积增大和力量增加等多种功能[10，11]。MGF已是当前研究的热点之一[12-14]。现有研究多集中于肌肉，对其他组织或细胞MGF的探讨较少。巨噬细胞能表达IGF-1，但其能否表达MGF国内外尚未见报道。运动特别是过度训练作为一种强烈应激，是否对巨噬细胞IGF-1和MGF表达产生影响，过度训练时补充巨噬细胞必需的能量物质谷氨酰胺是否影响其IGF-1和MGF表达，均无相关资料。故本研究通过观察过度训练及补充谷氨酰胺对大鼠巨噬细胞IGF-1、MGF基因表达的影响，为IGF-1和MGF研究开拓新视野。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

8周龄健康雄性Wistar大鼠40只，体重180± 10 g，购于中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（沪）2007-0005]。动物饲养环境温度为22 ± 2℃，相对湿度50%～70%，每日光照时间12 h，自由饮食。将大鼠随机分为安静对照组（C）、过度训练组（E）、过度训练补充谷氨酰胺组（EG）。后两组根据取材时间不同再分为2组：运动后36 h取材组（E1、EG1）和运动后7天取材组（E2、EG2）。总计5组，每组8只。

1.2 运动方案及谷氨酰胺补充方案

动物适应性饲养1周后，E组、EG组开始进行递增负荷跑台训练，每周训练6次，周日休息，共11周。运动方案参照文献的方法[15]（表1）。EG组L-谷氨酰胺（Sigma，产品编号G-3126）补充方案参考金其贯[16]方法并稍作修改，前4周逐周增加运动量至目标运动量，期间不补充谷氨酰胺，第5至8周灌胃（0.8 g/kg/d），以后几周加至饮用水补充，剂量逐周加大到1.1 g/kg/d。

表1 运动方案

1.3 腹膜巨噬细胞分离与纯化

最后1次训练后36 h或7天后，断头处死大鼠，腹腔注射12 ml RPMI1640培养液（GIBCO公司），腹部按摩2分钟后静置5分钟，在腹部作一长约2 cm切口并小心吸取腹腔灌洗液入离心管。离心去上清，0.1 M PBS洗两遍后用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的RPMI1640培养液重悬细胞并移入6孔板，于37℃、含5%CO2的培养箱中贴壁培养2 h，倾去不贴壁细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞[17]，PBS轻柔洗涤2次，加入PBS小心吹打细胞入离心管，离心去上清收集细胞。

1.4 RNA抽提与cDNA合成

使用异硫氢酸胍－氯仿经典法抽提总RNA，主要试剂Trizol购自invitrogen公司。按Fermentas公司第一链cDNA合成试剂盒（K1621）说明，在0.2 ml eppendorf管中进行反转录，反应条件为：65℃，5 min；4℃，2 min；25℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。反应总体积20 μl，合成的cDNA储存于-20℃备用。

1.5 荧光定量PCR

设计目的基因和内参基因荧光定量引物（表2），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。使用Rotor-Gene 3000定量PCR仪（Corbett Reseach）进行双标曲法相对定量PCR（SYBR Green试剂盒购自Fermentas公司）。标准曲线的构建：取PCR产物稀释一定倍数做标准曲线最高浓度点（105units），依次10倍梯度稀释，共6个浓度。MGF基因在1～105units范围内，检测阈值（CT）与拷贝数对数呈线性关系，两者相关系数r >0.99（图1）。样品中目的基因和内参基因CT值可通过各自标准曲线计算出相应浓度，二者比值即为该目的基因相对表达量，最后结果以处理组某基因表达量相对对照组变化倍数表示。此外，熔解曲线分析显示MGF呈单一产物峰。IGF-1资料相同。

表2 荧光定量PCR引物

图1 MGF标准曲线

1.6 统计学分析

实验数据用SPSS17.0统计软件处理，采用单因素方差分析，统计学水平定为0.05。

2 结果

表3显示，安静状态下巨噬细胞即可表达IGF-1和MGF。11周过度训练后36 h，巨噬细胞IGF-1、MGF表达量显著增加，分别约为安静对照组的21倍和92倍（P < 0.01）。EG1组IGF-1、MGF表达显著增加，分别约为安静对照的10倍和37倍（P < 0.01），但显著低于E1组（P < 0.01）。停训后恢复7天，E2组、EG2组IGF-1、MGF表达量分别与E1组、EG1组相比均显著降低（P <0.01），但与C组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。

表3 各组IGF-1、MGF基因表达（相对C组变化倍数）

3 讨论

本研究发现，安静状态下巨噬细胞内IGF-1和MGF均有表达。11周过度训练后，巨噬细胞IGF-1和MGF mRNA表达显著增加，与安静组相比分别增加了约21倍和92倍。巨噬细胞MGF表达相比IGF-1对运动应激更敏感，这与肌肉MGF表达水平对训练更敏感的报道一致[18]。运动后恢复期，IGF-1和MGF表达仍处于较高水平，但与安静对照组相比无显著性差异。因IGF-1和MGF有多种功能，因此，过度训练状态下巨噬细胞产生大量IGF-1和MGF可能参与机体多种生理过程。但巨噬细胞IGF-1和MGF过度活化对巨噬细胞产生何影响，相关资料较少。有报道显示，IGF-1有促进巨噬细胞分泌TNF-α[19]和IL-1β[20]等炎性因子，促进巨噬细胞摄取和降解低密度脂蛋白[21]，诱导巨噬细胞向炎症部位迁移参与炎症反应[3]，调控巨噬细胞的分化和存活[22]等多种功能。而国内外尚无MGF是否对巨噬细胞功能产生影响的研究。本课题组通过离体实验（另文发表）发现，不同浓度的重组IGF-1对巨噬细胞吞噬功能、活性氧生成无明显影响；而MGF呈浓度依赖性地抑制巨噬细胞的吞噬功能，较低浓度MGF对巨噬细胞胞内活性氧（ROS）生成产生明显的抑制作用。吞噬功能是巨噬细胞抵御病原入侵最重要的功能之一，生理浓度的ROS是巨噬细胞发挥其正常功能的基础[23-25]，因此，MGF对巨噬细胞吞噬和ROS产生明显抑制效应表明，MGF是巨噬细胞的负向调控因子。本研究中，过度训练使巨噬细胞通过自分泌形式产生大量MGF，抑制巨噬细胞功能，这可能是过度训练造成免疫抑制的机制之一。此外，本研究发现，补充谷氨酰胺可部分抑制巨噬细胞IGF-1和MGF对过度训练的应答，显著降低过度训练后巨噬细胞IGF-1和MGF增加幅度。这对巨噬细胞可能具有重要意义：即减轻MGF过度激活对巨噬细胞功能的不利影响，利于巨噬细胞维持正常功能。总之，本研究结果首次证明了巨噬细胞可表达MGF，且在过度训练时急剧增加，这将为MGF研究开启一个全新的视角：即巨噬细胞来源的MGF可能在机体多种生理活动中发挥重要作用。

4 总结

静息态巨噬细胞可表达IGF-1和MGF。过度训练可显著增强巨噬细胞IGF-1和MGF表达，且MGF表达对运动应激更敏感。补充谷氨酰胺可部分抑制巨噬细胞IGF-1和MGF对过度训练的应答。

[1]Murphy EA，Davis JM，Brown AS，et al. Role of lung macrophages on susceptibility to respiratory infection following short-term moderate exercise training. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287（6）：R1354-R1358.

[2]Adams GR. Role of insulin-like growth factor-I in the regulation of skeletal muscle adaptation to increased loading. Exerc Sport Sci Rev，1998，26（1）：31-60.

[3]Furundzija V，Fritzsche J，Kaufmann J，et al. IGF-1 increases macrophage motility via PKC/p38-dependent αvβ3-integrin inside-out signaling. Biochem Biophys Res Commun，2010，394（3）：786-791.

[4]Okura Y，Brink M，Zahid AA，et al. Decreased expression of insulin-like growth factor-1 and apoptosis of vascular smooth muscle cells in human atherosclerotic plaque. J Mol Cell Cardiol，2001，33（10）：1777-1789.

[5]Summan M，Warren GL，Mercer RR，et al. Macrophages and skeletal muscle regeneration：a clodronatecontaining liposome depletion study. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，290（ 6）：R1488-R1495.

[6]Cao B，Guo Z，Zhu Y，et al. The potential role of PDGF，IGF-1，TGF-beta expression in idiopathic pulmonary fibrosis. Chin Med J（Engl），2000，113（9）：776-782.

[7]DumontN，Frenette J.Macrophages protect against muscle atrophy and promote muscle recovery in vivo and in vitro： a mechanism partly dependent on the insulin-like growth factor-1 signaling molecule. Am J Pathol，2010，176（5）：2228-2235.

[8]Iida K，Itoh E，Kim DS，et al. Muscle mechano growth factor is preferentially induced by growth hormone in growth hormone-de ficient lit/lit mice. J Physiol，2004，560（2）：341-349.

[9]Yang SY，Goldspink G. Diffrent roles of the IGF-I Ec peptide（MGF） and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation. FEBS Letters，2002，522（1）：156-160.

[10]Barton-Davies ER，Shortuma DI，Musaro A，et al.Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15603-15607.

[11]Goldspink G. Impairment of IGF-I gene splicing and MGF expression associated with muscle wasting. Biochem Biol，2006，38（3）：481-489.

[12]史仍飞，卞玉华，危小焰. 振动训练对大鼠骨骼肌质量和肌细胞机械生长因子mRNA表达的影响. 中国运动医学杂志，2008，27（4）：508-510.

[13]肖卫华，陆耀飞. 骨骼肌损伤后修复过程中机械生长因子作用研究. 体育科学，2008，28（6）：34-38.

[14]肖卫华，陆耀飞. 机械生长因子实时荧光定量RT-PCR检测方法研究. 上海体育学院学报，2010，34（6）：43-45.

[15]HohlR，Ferraresso RL，DE Oliveira RB，et al. Development and characterization of an overtraining animal model. Med Sci Sports Exerc，2009，41（5）：1155-1163.

[16]金其贯. 谷氨酰胺和精氨酸对运动性免疫抑制干预作用的研究. 北京体育大学博士学位论文，2003. 45.

[17]黄胜，阳晓，李晓艳，等. 高糖对腹膜巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的作用. 中国病理生理杂志，2008，24（3）：588-590.

[18]Hameed M，Orrell RW，Cobbold M，et al. Expression of IGF-I splice variants in young and old human skeletal muscle after high resistance exercise. J Physiol，2003，547（1）：247-254.

[19]RenierG，Clément I，Desfaits AC，et al. Direct stimulatory effect of insulin-like growth factor-I on monocyte and macrophage tumor necrosis factor-alpha production.Endocrinology，1996，137（11）：4611-4618.

[20]Ueland T，Fougner SL，Godang K，et al. Associations between body composition，circulating interleukin-1 receptor antagonist，osteocalcin，and insulin metabolism in active acromegaly. J Clin Endocrinol Metab，2010，95（1）：361-368.

[21]Hochberg Z，Hertz P，Maor G，et al. Growth hormone and insulin-like growth factor I increase macrophage uptake and degradation of low-density lipoprotein. Endocrinology，1992，131（1）：430-435.

[22]Oberlin D，Fellbaum C，Eppler E. Insulin-like growth factor I messenger RNA and protein are expressed in the human lymph node and distinctly con fined to subtypes of macrophages，antigen-presenting cells，lymphocytes and endothelial cells. Immunology，2009，128（3）：342-350.

[23]Wang Y，Zeigler MM，Lam GK，et al. The role of the NADPH oxidase complex，p38 MAPK，and Akt in regulating human monocyte/macrophage survival. Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36（1）：68-77.

[24]Lee NK，Choi YG，Baik JY，et al. A crucial role for reactive oxygen species in RANKL-induced osteoclast differentiation. Blood，2005，106（3）：852-859.

[25]Roy KR，Arunasree KM，Dhoot A，et al. C-Phycocyanin inhibits 2-acetylaminofluorene-induced expression of MDR1 in mouse macrophage cells： ROS mediated pathway determined via combination of experimental and in silico analysis. Arch Biochem Biophys，2007，459（2）：169-177.