李博玲，马恒东，王 贞

（四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014）

本试验旨在研究褪黑素、谷胱甘肽两种抗氧化剂对精子冷冻的保护效应。通过对冷冻过程中活性氧（ROS）的检测以及冻后精子活率、活力、顶体完整性、线粒体活性的检测，筛选出较佳的抗氧化剂添加搭配组合，为猪冻精技术的发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 健康、性欲旺盛成年杜洛克公猪，2008年10月至2009年4月 ，共采精13次。

1.1.2 试剂及耗材 主要试剂：褪黑素（MLT）、碘化炳碇（PI）、罗丹明 123，均为 Sigma公司产品；谷胱甘肽（GSH）、ROS初级荧光检测试剂盒购自成都溶海生物技术有限公司；甘油为Amresco公司产品；乳糖购自成都科龙化工试剂厂。

主要耗材：低温温度计为北京市宇时技术开发公司生产；倒置荧光显微镜为尼康公司生产；电子天平为沈阳龙腾电子有限公司生产；全自动酶标仪为Thermo公司生产；0.5mL冷冻细管为沈阳富士平工业有限公司生产。

1.1.3 冷冻稀释液和解冻液的配制 见表1。

表1 冷冻稀释液和解冻液的成分和剂量

1.2 试验设计 实验一：在稀释液中分别单独添加MLT、GSH，观察对精液冷冻保存的影响。

实验二：在稀释液中联合添加MLT、GSH，观察对精液冷冻保存的影响。

实验三：联合添加与单独添加两种抗氧化剂的比较。

1.3 方法

1.3.1 精液预处理及冷冻 用手握法采集中段精液浓稠部分，并立即用BTS等温稀释（1∶1），镜检活力在0.7以上的用保温瓶带回实验室。室温静置2h，用50mL 离心管分装、离心（2400×g，3min），去上清后加入乳糖-卵黄稀释Ⅰ液（1∶1），放入4℃冰箱缓慢降温、平衡约 2h，再加入乳糖-卵黄稀释Ⅱ液（1∶1）4℃平衡20min后，装管，液氮熏蒸（离液氮面 5cm，20min），投入液氮保存。……