关晔晴,陈红兵,张宝俊,韩巨才,刘慧平

(1.山西农业大学农学院,山西 太谷030801;2.山西农业大学 文理学院,山西 太谷030801)

化学农药的广泛使用,给人类健康及环境安全带来严重威胁,随之而来的抗药性问题也日渐突出。从微生物中寻找发现新型先导化合物,是生物农药研制的重要途径[1～3]。放线菌是一类重要的微生物资源,目前从微生物中分离的抗生素类物质有60%以上来源于放线菌的代谢产物[4～7],如春雷霉素、公主岭霉素、波拉霉素、武夷菌素、中生霉素、多抗菌素等[8],其中部分抗生素已得到开发,并在生产实践中取得了良好的防治效果。本试验前期从1株辣椒内生娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)中分离到1种化合物3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚[9,10],目前,国内外关于该物质对植物病原真菌拮抗活性方面的研究较少,本研究以3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚为研究对象,测定了其对6种常见植物病原真菌的抑制作用,为进一步研究其作用机制,将其开发成为生物农药新品种提供试验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂PDA(Potato Dextrose Agar)培养基:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂20 g,H2O 1000 mL。

1.1.2 供试病原菌

番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦叶枯病菌(Alternaria triticina)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinf ectum)、梨黑斑病菌(Alternaria alternata),以上病菌均由山西农业大学化保实验室提供。

1.1.3 供试药剂

3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚(本实验室合成)、丙酮(天津市化学试剂六厂)、Tween80(天津市北辰方正试剂厂)、75%WP甲基托布津(日本曹达株式会研制)、50%WP多菌灵(海南江河农药化工有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 对6种病菌菌丝抑制作用的测定

采用FAO推荐的菌落直径法[11]。将3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚用体积分数为50%的丙酮溶解,分别用无菌水稀释到100,200,400,800,1600 mg◦L-15个浓度,将各浓度药液分别与PDA培养基按1∶9的比例混合制备含药平板。分别接入直径5 mm的供试6种病原菌新鲜菌块,在25℃条件下培养5 d后,测定不同浓度下各处理的菌落直径,重复3次,以含体积分数为50%的丙酮为对照。用DPS6.0软件分析毒力回归方程式、EC50值和95%置信限。

1.2.2 对6种病菌孢子抑制作用的测定

对病原菌孢子萌发抑制作用采用悬滴法[12]。制备孢子悬浮液,将3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚配制成50,100,200,400,800 mg◦L-15个浓度溶液,分别与等体积的孢子悬浮液混合,保湿培养12、24 h后,在光学显微镜下观察孢子的萌发情况。以芽管长度超过孢子直径1/2计为萌发,重复5次,以无菌水为对照。

1.2.3 与2种杀菌剂毒力差异的测定

分别将75%WP甲基托布津、50%WP多菌灵制备浓度为10 000 mg◦L-1的母液,再根据预试验测定结果将各药剂分别用无菌水稀释为1.2.2述5个不同的浓度药液,将各浓度药液分别与PDA培养基按1∶9的比例混合制备含药平板。分别接入直径为5 mm的新鲜病菌菌块,在25℃条件下恒温培养5 d后,测定不同浓度下各处理的菌落直径,重复3次,以无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 对6种病原菌菌丝生长的影响

测定结果如表1所示:3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对6种病原菌菌丝的生长均有一定的抑制作用,其 EC50在 186.48～711.78 mg◦L-1之间,其中对番茄灰霉病菌的抑制作用最强,其EC50为186.48 mg◦L-1,对番茄早疫病菌的抑制作用次之,EC50为202.29 mg◦L-1;再次为对小麦赤霉和辣椒枯萎病菌的抑菌作用,EC50分别为372.56和468.33 mg◦L-1;对小麦叶枯和梨黑斑病菌的抑制作用最弱,EC50分别为 627.78和 711.78 mg◦L-1;表明3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚的抗菌谱较广,但对不同病原菌的抑菌活性可能存在一定差异。

表1 对6种病原菌菌丝生长的影响Table 1 The effect on mycelial growth of six kinds of pathogens

2.2 对6种病原菌孢子萌发的影响

测定结果如表2所示:3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对所测6种病原菌孢子的萌发均有一定的抑制作用,对番茄灰霉、梨黑斑和番茄早疫病菌的抑制作用较强,EC50分别为 171.93、173.74和183.91 mg◦L-1,其次为小麦叶枯和辣椒枯萎病菌,EC50分别为 204.12和 205.34 mg◦L-1,对小麦赤霉病菌孢子萌发的抑制作用最弱,其EC50为337.85 mg◦L-1。研究结果表明,3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对病原菌孢子萌发的抑制作用强于对病菌菌丝的抑制作用,但抑制强弱与对菌丝生长的抑制作用有所不同。

2.3 与2种杀菌剂的毒力差异比较结果

测定结果如表3所示:3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对番茄早疫病菌和梨黑斑病菌的EC50分别为202.29和711.78 mg◦L-1;甲基托布津对两种病菌的EC50分别为58.89和47.04 mg◦L-1;多菌灵对两种病菌的 EC50分别为 643.38和1208.87 mg◦L-1;与甲基托布津相比,该物质对两种病菌的EC50较高;而与多菌灵相比,该物质对两种病菌的EC50明显小于多菌灵,存在显著性差异。说明3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对以上2种病菌的抑菌效果优于杀菌剂多菌灵,有一定的实用价值。

表2 对6种病原菌孢子萌发的影响Table 2 The effect on spore germination of six kinds of pathogens

表3 与2种杀菌剂的毒力差异的比较Table 3 The comparison of virulence differences with two fungicides

3 结论与讨论

本试验研究结果表明:3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、小麦叶枯病菌、梨黑斑病菌菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用,表明该物质的抗菌谱较广,但针对不同病原菌,其抑制效果可能存在差异,如对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制作用最强,EC50为186.48 mg◦L-1,对梨黑斑病菌的抑制作用最弱,EC50为711.78 mg◦L-1,这可能与不同病原菌的形态差异、生理生化特性等有一定的相关性。同时,该物质对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用亦最强,表明该物质对番茄灰霉病菌有一定的实用价值。与常用杀菌剂相比,该物质对部分病原菌的抑菌活性优于广谱性杀菌剂-多菌灵的抑菌活性,表明3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚有进一步开发为生物农药的应用价值。

3,5-二叔丁基-4羟基-苄基甲醚是在试验组前期从1株辣椒内生娄彻氏链霉菌代谢产物中分离得到的一种化合物,娄彻氏链霉菌仅在医药[13]方面的应用有所报道,代谢产物在抗真菌活性方面还未查到有文献报道。本试验测定了该物质对6种常见植物病原菌的抑制作用,虽然试验中测定的EC50高于广谱性杀菌剂甲基托布津,但其为微生物分泌的代谢产物,该物质可能与环境有很好的相容性,而且不易使病原菌产生抗药性,因此具有一定的开发应用价值。下一步将通过对该化合物进行基团改造,力争提高该化合物的杀菌效果。同时,本试验仅在室内通过生物测定的方法分析了该物质的抑菌活性,关于其在田间防效的研究正在进行中。

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