李智媛，屈淑平，崔崇士

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

南瓜属作物的种子属于双子叶无胚乳型种子，由种皮和胚组成。根据南瓜种子种皮的结构特点，将南瓜分为有壳南瓜种子和无壳南瓜种子，常见的南瓜为有壳南瓜，而无壳南瓜又称裸仁南瓜，它是在有壳南瓜中发现的突变体，种壳在发育过程中退化为薄薄的一层膜，目前在美洲南瓜和中国南瓜中均存在无壳突变种[1－4]。控制美洲南瓜裸仁性状的基因为隐性基因n，控制中国南瓜裸仁性状的基因为隐性基因n-2[5]。无壳南瓜种皮退化，种仁裸露，可以直接加工食品和食用，免去了脱皮的加工工序和加工损失，降低加工成本，出仁率高，营养丰富，是一种优异的南瓜种质资源[6]。鉴定和克隆南瓜裸仁基因n对于南瓜育种具有重要理论和实践意义。

本试验中利用AFLP技术筛选与裸仁基因n紧密连锁的分子标记，为建立裸仁性状的分子标记辅助育种，开展裸仁南瓜育种提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及基因组DNA的准备

以有壳品系“金辉二号－2”为母本，无壳品系“0516－2”为父本配制正反交组合，F1与无壳亲本进行回交，F1代自交获得F2代种子。2008年春季，在东北农业大学试验实习基地种植亲本、F1、F2及回交世代。对F2代和回交世代进行性状分离调查，统计分离比率。父母本及各世代材料幼叶在液氮中冷冻，-80℃保存，DNA的提取采用CTAB微量法提取[7]。

1.2 AFLP反应程序

1.2.1 酶切-连接

采用Eco RⅠ和MseⅠ对基因组DNA进行双酶切，酶切-连接一步进行，预扩引物为E00和M00组合，选择性扩增采用E+2/M+3引物组合。在总体积25 μL的酶切-连接体系中Eco RⅠ(10 U·L-1)和MseⅠ（10 U·L-1）用量各为 0.25 μL、模板 DNA（50 ng·L-1）1 μL、Eco RⅠ接头（5 pmol·L-1）和 MseⅠ接头（50 pmol·L-1）各 0.5 μL、ATP （10 mmol·L-1）0.5 μL、10×Buffer 2.5 μL、T4DNA 连接酶（5 U·L-1）0.3 μL、ddH2O 19.2 μL，混匀后37℃下反应8 h。

1.2.2 预扩增

预扩增体系20 μL，其组成为酶切连接产物5 μL、10×PCR buffer 2 μL、dNTP （10 mmol·L-1）1.6 μL、E00 引物（50 ng·L-1）0.6 μL、M00 引物（50 ng·L-1）0.6 μL、Mg2（＋25 mmol·L-1）2.5 μL、Taq酶（5 U·L-1）0.2 μL、ddH2O 8.8 μL。混匀离心后用以下程序扩增：94℃3min；94℃1min，56℃1min，72℃2 min，25 cycles；72℃10 min；4℃保存。

预扩增产物于-20℃保存或稀释后用于选择性扩增。

1.2.3 选择性扩增

选择扩增体系20 μL，其组成为预扩增产物稀释 30 倍后取 5.0 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）1.2 μL、Eco RⅠ引物（50 ng·L-1）1.2 μL、MseⅠ引物（50 ng·L-1）1.2 μL、Taq 酶（5 U·L-1）0.25 μL、ddH2O 7.55 μL。混匀离心后用以下程序扩增：94℃3 min，1 cycle；94℃30 s，65 ℃ 30 s（-0.7 ℃/cycle），72 ℃1 min，12 cycles；94℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min（+1s/cycle），30 cycles；72 ℃ 10 min。

选择性扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法进行染色。

1.2.4 AFLP引物的选择

根据南瓜作物的基因组大小和碱基偏好性选择了含有2个选择性碱基的16个Eco RⅠ引物和含3个选择性碱基的16个MseⅠ引物配对所得的256对引物组合，对亲本间扩增条带进行比较。选择亲本间多态性好、条带清晰、重复性强的组合再进行复筛，筛选出20对差异性多和多态性好的引物做为F2代群体分离研究的引物组合（见表1）。

表1 用于金辉二号-2×0516-2 F2群体单株选择性扩增的特异引物Table 1 Primers used for amplification of F2individual plants of Jinhui2-2×0516-2

1.2.5 AFLP特异片段的克隆、测序和SCAR标记转化

直接用灭菌的手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶上割取含目标片段的胶条，浸泡在30 μL ddH2O中，经37℃过夜，95℃水浴煮30 min，使其充分融化，5 000 r·min-1离心 3 min。浸出液 1 μL 用作PCR扩增模板，反应条件参照选择扩增试验，PCR扩增产物采用大连宝生物工程有限公司胶回收试剂盒进行，回收片段与载体选用Promaga生产的pGEM-T Easy vector进行连接、转化，酶切验证正确后委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

测序结果用BLAST程序进行序列比对，根据序列结果，利用Primer 5.0设计1对SCAR引物：SCAR-E： 5′CAACATATGGAAAATCGGG 3′，SCAR-M：5′TGCGTACCAATTCGACACT 3′。以父母本、F1和F2各单株的DNA为模板进行SCAR引物的PCR特异性鉴定和获得SCAR标记。

1.2.6 数据统计

利用χ2检验分析各标记是否符合分离比例、AFLP多态性标记与田间种皮性状的分离情况，应用Mapmaker3.0软件分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距（cM），以最大图距50 cM作为划分连锁群和排列标记的基准距离。计算连锁遗传距离，临界LOD值取3.0。

2 结果与分析

2.1 种壳性状分离分析

F1代自交获得193个F2代植株。通过逐一观察植株果实种子表现出有壳和无壳两种性状，分离比例见表2。在193株F2代单株中发生性状分离，表现为有壳150株，无壳43株，根据χ2测验χ2c＜χ2(0.05，1)=3.84，差异不显著，表明南瓜种皮性状在0.05水平上符合3∶1分离比，即南瓜种皮性状符合一对等位基因的表型分离比例。回交共获得100个植株，逐一观察果实内种子，其植株间同样出现了无壳与有壳两种性状，分离比例见表3。对表3结果同样进行 χ2c检验，计算出 χ2c=2.89，而 χ2(0.05，1)=3.84，χ2c＜ χ2(0.05，1)，检验未达显著水平，表明回交后代种皮性状分离符合1∶1比例。经以上自交、回交代结果分析表明，无种壳美洲南瓜种皮性状F2代分离符合孟德尔分离规律，可以确认无种壳（裸仁）性状是受一对隐性核基因 (nn)所控制，而且独立遗传，当隐性基因为同质时，种壳性状表现为无壳（裸仁）。

表2 F2代群体种皮性状分离统计Table 2 Segregation ratio of testa trait in F2populations

表3 回交世代种皮性状分离统计Table 3 Segregation ratio of testa trait in backcross populations

2.2 AFLP引物筛选及F2单株PCR

用256对选择性扩增引物对亲本金辉二号－2和0516－2进行筛选，筛出差异引物94对，筛出率36.72%，每对引物扩增出70～100条谱带。用基因池进行复筛，筛出20对差异性多和多态性好的引物。利用复筛得到的20对引物对金辉二号－2×0516－2 F2群体的193个单株进行选择性扩增，共扩增出99条特异带，平均每对引物扩增出4.95条特异带。对每个标记的带型在F2群体中的分布进行χ2测验，结果基本符合3:1的分离比例，有4个位点产生偏分离（P＜0.05），偏分离比例为4.04%。偏分离的原因可能是由于环境因素造成的配子比例失调。

2.3 F2群体遗传距离的确定

采用Mapmaker3.0软件对分离群体单株的裸仁性状和分子标记的分离数据进行连锁分析，找到4个与裸仁基因n连锁的分子标记，分别为：E19M60－C、E22M48－B、E13M60－A 和 E25M51－D，遗传距离分别为8.9、14.1、17.5和18.8 cM（见图1）。

图1 裸仁基因的AFLP标记定位Fig.1 Location of hull-less n gene by AFLP technique

2.4AFLP标记转化为SCAR标记

将含有目的DNA片段的菌液，送交上海生工生物工程技术服务有限公司，结果表明序列的两端均有AFLP引物的结合位点，进一步证实了克隆片段的正确性。碱基序列见图2，该片段长度为318 bp。

图2 E19M60-C片段核苷酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of fragment E19M60-C

在NCBI中检索与其具有相似性的基因信息，在核苷酸水平与在氨基酸水平均未发现明显同源序列，推测为南瓜的一段新的基因片段。

根据测序结果设计SCAR引物，在55℃退火条件下获得较好的扩增结果，PCR产物大小为318 bp，与其相对应的AFLP标记的扩增结果完全对应，命名为SCAR318。以此引物对F2群体中的单株进行PCR扩增，验证SCAR标记的稳定性，以确定SCAR标记转化的正确性。其部分扩增结果见图3所示。结果表明，该对引物在裸仁亲本、F1和F2代表现裸仁的单株中有扩增，在有壳亲本及F2代表现有壳的单株中无扩增。

本研究中将AFLP标记转化成稳定的SCAR标记，长度为318 bp。

图3 SCAR标记在部分F2代群体的检测结果Fig.3 Detection of the SCAR marker in F2population and parents

3 讨论

无壳南瓜与有壳南瓜正反交，其F1代种子均表现为有壳，表明种壳性状由核基因控制。杂种F2代有壳与无壳的分离比例为3∶1，回交后代其分离比例为1∶1，表明无种壳（裸仁）性状的基因突变系点突变，是一对质量性状，无壳性状系隐性基因控制，这与以往研究结果相一致[2-4,8]。另外，在F2代中，无壳种子不同程度地出现了带薄壳现象，这些薄壳的表现从种子边缘带壳到全种子表面带薄壳的连续表现的性状，推测南瓜种壳性状遗传还存在修饰基因控制，通过修饰基因控制这样一个连续变异的性状，张仲保等研究表明种子薄壳是数量性状，系修饰基因控制，估算种子薄壳遗传中至少涉及38对基因[8]，Teppner认为至少受到9个微效基因的修饰[9]，表明无种壳性状遗传比较复杂，不仅是简单的单基因控制，还受到其他微效基因的控制，需要进一步明确其遗传机理。

目前关于南瓜裸仁基因定位研究比较少。Zraidi等利用RAPD、AFLP、SSR和形态标记技术，对南瓜裸仁基因n进行定位，分别对两个F2代群体分析，找到了7个标记与裸仁基因n距离小于7 cM，其中AW11-420与n相距4 cM[10]；本研究以F2群体为试验材料采用AFLP标记对南瓜种壳性状进行标记，获得4个与无壳（裸仁）性状连锁的分子标记，最近的标记为E19M60-C。本试验得出的标记遗传距离较远，可能是由于引物数量少及试验所用群体有关，因此，应加大引物量，构建近等基因系或重组群体以便找到与目标性状紧密连锁的标记。另外，获得的SCAR标记只是在亲本、F1和部分F2代中验证与无壳表型的一致性，还应在其他种质资源材料中进一步验证其准确性，以确定其使用价值。

4 结论

本研究以有壳品系“金辉二号-2”为母本和无壳品系“0516-2”为父本配制组合，获得F1、F2和回交世代群体，遗传规律分析表明，无种壳（裸仁）性状是受一对隐性核基因所控制，而且独立遗传，当隐性基因为同质时，种壳性状表现为无壳（裸仁）。以193个F2单株作为作图群体，利用AFLP分子标记技术和集群分析法对与美洲南瓜裸仁基因连锁的分子标记进行研究，找到了与裸仁基因n连锁的4个AFLP标记：E19M60-C、E22M48-B、E13M60-A和E25M51-D，连锁遗传距离分别为8.9、14.1、17.5和18.8cM。并将E19M60-C转化为SCAR标记。

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