底建敏 崔文华 蒋乃 孙桂兰 郭影

葡萄胎是一种多发于育龄女性且严重威胁女性生命和健康的严重疾病，由于多种因素或治疗不当葡萄胎可以转化为侵蚀性葡萄胎或绒毛膜癌，严重影响患者的治愈率和生存率。在某些肿瘤细胞中环氧合酶-2(COX-2)过度表达，Survivin在正常组织中不表达或低表达，而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈高表达，本文通过检测COX-2和Survivin在葡萄胎组织中的表达，探讨其在葡萄胎发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2000年3月至2008年10月河北医科大学第三医院妇产科第一次清宫术后葡萄胎组织标本60例，所有标本均为首次清宫标本并经HE染色病理检查确诊。患者平均年龄32.5岁，平均孕周10.5周，所有葡萄胎患者均进行2年随访，其中17例发现恶变(葡萄胎恶变组)。取同期正常早期妊娠行人工流产术的绒毛组织标本20例作为对照组，年龄18～36岁，平均年龄30.5岁，平均孕周8.5周。采集患者的标本迅速置入液氮中冷冻，然后放入－70℃冰箱保存。

1.2 免疫组织化学PV-6000法 采用免疫组化PV-6000法检测COX-2和Survivin的表达，鼠抗人COX-2单克隆抗体即用型抗体购自北京中杉生物技术有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗体为santa cruze公司产品，由北京中杉生物技术有限公司分装。PBS代替一抗做为阴性对照，实验步骤严格按试剂盒说明进行。染色强度评分参照formwitz阳性细胞半定量分级评分方法［1］:每张切片选择有代表性的区域，并避开切片周边区域，随机检测5视野(倍数×400)，根据阳性细胞百分率，0为0分，＜25%为1分，25% ～50%为2分，＞50%为3分;按显色深浅无显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分率及显色深浅评分相乘最后得分:0～1分为阴性(－);2分为弱阳性(+);3～4分为阳性(++);5～6分为强阳性(+++)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，Survivin及COX-2表达的相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2蛋白在葡萄胎组织中的表达 所有的标本COX-2蛋白表达定位于滋养细胞胞浆内。COX-2蛋白阳性表达率在对照组、葡萄胎未恶变组及葡萄胎恶变组中分别为35.0%(7/20)、58.1%(25/43)和 94.1%(16/17)。对照组与葡萄胎未恶变组表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);葡萄胎未恶变组及葡萄胎恶变组表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);对照组与葡萄胎恶变组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 Survivin蛋白在葡萄胎组织中的表达 Survivin阳性染色定位于细胞浆内及细胞核内，以细胞浆为主。在对照组、葡萄胎未恶变组以及葡萄胎恶变组中的阳性表达率分别为25.0%(5/20)、41.9%(18/43)和76.5%(13/17)。对照组与葡萄胎未恶变组表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);葡萄胎未恶变组及葡萄胎恶变组表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);葡萄胎恶变组Survivin蛋白表达水平高于对照组(P＜0.01)。

2.3 COX-2与Survivin在葡萄胎组织中表达的相关性 COX-2和Survivin在葡萄胎的发生发展过程中呈正相关(r=0.361，P＜0.05)。

3 讨论

COX是催化花生四烯酸转变成前列腺素的限速酶，它将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物从而参与维持机体的各种生理和病理功能。COX有2种同工酶:COX-1和COX-2。研究发现COX-1和COX-2在女性生殖系统中都有表达，COX-1基因缺陷的雌鼠生殖能力没有影响［2］，但表现为COX-2在种植前期代偿性表达上调［1］，而COX-2基因缺陷的雌鼠由于排卵、受精、种植和蜕膜化缺陷而致不育，从而提示COX-2与女性生殖关系密切［3］。Johansen等［4］通过 PCR方法证实COX-2存在于胎盘、绒毛和羊膜中。Slater等［5］的研究显示COX-2 mRNA在胎膜中的表达随孕周增加而增加，在分娩前明显增加并与分娩的发动有关。临床上HCG＞100 kU/L视为葡萄胎恶变的高危因素，而HCG水平对COX-2表达有上调作用。本试验结果显示COX-2在对照组、葡萄胎未恶变组及葡萄胎恶变组的表达率呈递增趋势，葡萄胎恶变组COX-2蛋白表达水平明显高于对照组。COX-2蛋白表达增高可能通过促使滋养细胞的增殖，抑制滋养细胞的凋亡，促进肿瘤血管形成等机制使葡萄胎组织中的滋养细胞无限增殖，最后发展为侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌。

Survivin是凋亡抑制家族(IAP)的成员之一，Survivin基因在正常组织中不表达或低表达，而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈高表达［6］，是一类结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能［7］。研究表明葡萄胎恶变与滋养细胞低凋亡活性有关，Wong等［8］检测发现所有葡萄胎的合体滋养细胞、细胞滋养细胞均有凋亡发生。Shiozaki等［9］用RT-PCR、免疫组化法检测正常胎盘组织、两种人类绒癌细胞系(JEG23和Bewo)和一种滋养细胞系(tPA3021)中Survivin mRNA和蛋白的表达，结果显示3种组织中均有Survivin mRNA的表达。本研究结果显示正常绒毛及蜕膜细胞亦可见Survivin的部分阳性表达。对照组、葡萄胎未恶变组以及葡萄胎恶变组Survivin表达由弱至强，且葡萄胎恶变组中Survivin阳性表达率高于对照组。一方面Survivin的高表达使细胞呈低凋亡活性，破坏细胞增殖与凋亡之间的平衡，从而增强滋养细胞的侵蚀性，导致葡萄胎向侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌的转变。另一方面，在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌的发生发展中Survivin过度表达可能促进滋养细胞逃离生长监控，使细胞生存延长，转化突变的细胞积累并进而参与妊娠滋养细胞肿瘤的发生发展。

有动物实验研究发现，COX-2与Survivin在抑制肿瘤细胞凋亡过程中发挥共同促进作用［10］。Barnes等［11］在乳腺癌研究中发现COX-2和Survivin蛋白的表达呈正相关，认为COX-2和Survivin双表达是乳腺癌患者术后复发的危险因素。本研究结果发现，COX-2和Survivin在葡萄胎的发生发展过程中呈正相关，但两者间的作用机制有待进一步探究。

由于滋养细胞肿瘤的病因不明，所以早期诊断、确定滋养细胞肿瘤的性质以便及早治疗及预测病变转归是治疗的关键。本研究结果显示恶变的葡萄胎组织COX-2过度表达和Survivin高表达使细胞呈低凋亡活性在妊娠滋养细胞疾病的发生和发展中发挥着重要的作用，二者可联合作为反映妊娠滋养细胞疾病生物学行为的有效指标，为早期诊断和治疗提供新的依据。

1 Reese J，Brown N，Paria BC，et al.Cox-2 compensation in the uterus of cox-1 deficient mice during the pre-implantation period.Mol Cell Endo，1999，150:23-31.

2 Langenbach R，Morham SG，Tiano HF，et al.Prostaglandin synthase 1 gene disruption in mice reduces arachidonic acid-induced inflammation and indomethacin-induced gastric ulceration.Cell，1995，83:483-492.

3 Lim H，Paria BC，Das SK，et al.Multiple female reproductive failures in cyclooxygenase 2-deficient mice.Cell，1997，91:197-208.

4 Johansen B，Rakkestad K，Balboa Ma，et al.Expression of cytosolic and secreted forms of phospholipase A(2)and cyclooxygenases in human placenta，fetal membranes，and chorionic cell lines.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2000，60:19-25.

5 Slater D，Dennes W，Sawdy R，et al.Expression of in human fetal membranes throughout pregnancy.J Mol Endocrinol，1999，22:15-30.

6 Stauber RH，Mann W，Knauer SK.Nuclear and cytoplasmic Survivin:molecular mechanism，prognostic，and therapeutic potential.Cancer Res，2007，67:5999-6002.

7 Shin S，Sungb J，Cho YS，et al.An anti-apoptotic protein human Survivin is a directinhibitor of caspase-3 and caspase-7.Biochemistry，2001，40:1117-1123.

8 Wong SY，Ngan HY，Chan CC，et al.Apoptosis in gestatio-nal trophoblastic disaese is correlated with clinical outcome and bcl-2 expression but not bax expression.Mod Pathol，1999，12:1025-1033.

9 Shiozaki A，Kataoka K，Fujimura M，et al.Survivin inhibits apoptosis in cytotrophoblasts.Placenta，2003，24:65-76.

10 Krysan K，Dalwadi H，Sharma S，et al.Cyclooxygenase 2 dependent exp ression of Survivin is critical for apoptosis resistance in non small cell lung cancer.Cancer Res，2004，64:6359-6362.

11 Barnes N，Haywood P，Flint P，et al.Survivin exp ression in insitu and invasive breast cancer relates to COX-2 expression and DCIS recurrence.Br J Cancer，2006，94:253-258.