刘若诗，万晶晶，黄卫宁,*，刘 刚，RAYAS-DUARTE Patricia

(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.杭州知味食品有限公司，浙江 杭州 311107；3.美国俄克拉荷马州立大学农产品与食品研究中心，美国 俄克拉荷马州 斯蒂尔沃特 74078-6055)

冻干酸面团发酵剂对发酵面团及面包香气的影响

刘若诗1，万晶晶1，黄卫宁1,*，刘 刚2，RAYAS-DUARTE Patricia3

(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.杭州知味食品有限公司，浙江 杭州 311107；3.美国俄克拉荷马州立大学农产品与食品研究中心，美国 俄克拉荷马州 斯蒂尔沃特 74078-6055)

采用HPLC和SPME/GC-MS，研究冷冻干燥(冻干)旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对普通和全麦发酵面团及其面包香气的影响。结果显示，冻干旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranscensis，L.s.)酸面团发酵剂对发酵面团和面包香气的影响显著。酸面团面包面团中有机酸和游离氨基酸含量均高于相应的非酸面团面包面团；乳酸菌酸面团发酵显著提高了面包中挥发性物质的含量，L.s.高筋粉酸面团面包(SSAB)和L.s.全麦酸面团面包(SSWB)较非酸面团高筋粉面包(NSHB)和非酸面团全麦面包(NSWB)分别提高了11.31%和14.98%。全麦体系含有更多的游离氨基酸，其面包具有更浓郁的风味，全麦酸面团面包所含挥发物质总量大幅高于普通面包，NSWB和SSWB较NSHB和SSAB分别提高了22.54%和26.58%。3-甲基-1-丁醇、乙酸、糠醛、苯乙醇、3-羟基-2-丁酮、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁醛和E-2-壬烯醛是面包中重要的香气物质。L.s.酸面团发酵剂在不同面粉面团体系中产生的作用不同，SSAB含有较多的内酯类化合物；SSWB含有更多的3-甲基-1-丁醇和3-羟基-2-丁酮。

冻干酸面团发酵剂；旧金山乳杆菌；发酵面团；香气；有机酸；游离氨基酸

酸面团技术作为在商业酵母出现之前的自然发酵生物技术在几千年前已经开始得到应用[1-2]，具有诸多突出优点，如改善面包质构[3-4]、风味[5-6]和提高营养价值等[7-8]。面粉中天然存在乳酸菌，传统酸面团主要为自然发酵，而有选择的使用乳酸菌种可以优化发酵过程，L. sanfransiscensis(L.s.)是其中典型、重要的发酵菌种[9-10]。利用冷冻干燥(冻干)技术可以延长酸面团的保质期[11-12]，即将其制成酸面团发酵剂，简化酸面团制品的加工过程，使用更加方便快捷。

面包中的关键性风味物质主要存在于面粉中，发酵基质对于面包香气的形成至关重要，高灰分的全麦粉能够促进挥发性物质的生成[13]。酸面团发酵对面包香气的促进作用包括两个方面：不挥发性风味物质，如乳酸菌代谢产生的有机酸降低面团的pH值从而影响面包香气，某些游离氨基酸则是面包风味物质的重要前体；挥发性风味物质，包括生物代谢、生化反应和热作用产生的醇、醛、酮、酯和芳杂环化合物等[5,14]。

固相微萃取技术(SPME)与气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)是准确分析和鉴定食品风味物质的重要方法[15-16]。面包中已经发现的挥发性风味物质有500多种[17]，但关于冻干乳酸菌酸面团发酵剂以及乳酸菌和酵母菌混合发酵对面包的影响罕有报道。本实验采用HPLC和SPME/ GC-MS，研究冻干旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对普通和全麦发酵面团及其面包香气的影响，为深度开发烘焙发酵食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高筋粉 中粮东海粮油工业(张家港)有限公司；全麦粉 江苏新良面粉有限责任公司；普通粉 丹阳市同乐面粉集团有限公司；即发活性干酵母 番禺梅山-马利酵母有限公司；旧金山乳杆菌(DSM20451T) 德国DSMZ微生物菌种保藏中心；起酥油 江门市百鲜食品有限公司。

白砂糖、盐 市售；高氯酸、氢氧化钾、三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司；微孔滤膜 上海兴亚净化材料厂。

1.2 仪器与设备

5K5SSWH搅拌机 美国Kitchenaid公司；B10B高速强力食品搅拌机 恒悦食品机械有限公司；醒发柜、烤箱 上海早苗电器有限公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；TGL-16G高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；Agilent1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Trace MS气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan公司；固相微萃取装置以及75μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 旧金山乳杆菌酸面团发酵剂制备

在MRS培养基中将菌种活化后培养至对数后期，取菌液(＞108CFU/mL)于4000r/min离心15min[18]。称取等量的面粉和水，接入活化菌泥(0.25g/100g)，混匀密封，放入30℃恒温恒湿培养箱中发酵至pH4。将新鲜的酸面团发酵剂灌入培养皿，厚度0.8cm，于-70℃预冻2h后冻干38h，真空度为20Pa。冻干的酸面团发酵剂于4℃储藏。SA为L.s.普通粉发酵剂，SW为L.s.全麦粉发酵剂。

1.3.2 面包的制备

表1 面包配料Table 1 Ingredients of breads (flour weight basis) g/100g面粉

将表1配料混合慢速搅拌成团，再快速搅拌10min至面筋网络结构形成，室温覆膜静置松弛8min，切分(100g/个)、搓圆、整形，放入模具于38℃，相对湿度80%条件下醒发1h，留样进行HPLC分析，其余于上火150℃，下火200℃烘焙25min，室温冷却后进行SPME/GC-MS分析。

1.3.3 发酵面团中有机酸和游离氨基酸测定

1.3.3.1 有机酸测定

称取10g发酵面团，加入90mL去离子水高速匀浆30s，取10mL浆液加入5mL 1mol/L HClO4混匀，于4℃、5000r/min离心15min，上清液用2mol/L KOH中和至pH4.5，加水调体积至25mL，冰浴沉淀，将清液微滤(0.45μm)后进行HPLC分析，测定乳酸和乙酸的含量[19]。

色谱条件：Ecosil C18，流动相为甲醇-水-H3PO4(体积比为95:5:0.05)，流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量10μL，210nm紫外检测。

1.3.3.2 游离氨基酸测定

称取10g发酵面团，加入25mL 5g/100mL三氯乙酸高速匀浆30s，于10000r/min离心10min后两层滤纸过滤，上清液于10000r/min离心10min后用邻苯二醛进行柱前衍生，然后使用HPLC进行游离氨基酸分析。

色谱条件：ODS Hypersil毛细管色谱柱(250mm× 4.6mm，5μm)，流动相为20mmol/L乙酸钠的甲醇-乙腈溶液(体积比为1:2)，流速1.0mL/min，柱温40℃，338nm紫外检测。

1.3.4 面包挥发性成分分析

1.3.4.1 挥发性成分的顶空固相微萃取

称取面包样品约5g，放入15mL SPME样品瓶中，样品约占瓶体积的3/5，然后将样品瓶置于60℃恒温水浴中，将老化好的萃取头插入样品瓶的上空，顶空萃取40min。用手柄将纤维头退回到针头内，拔出针头进样。

1.3.4.2 挥发性物质分析

色谱条件：DB-WAX 122-7032毛细管色谱柱(30m× 0.25mm，0.25μm)；载气He流量：恒流，0.8mL/min；升温程序：起始温度40℃，保留3.5min，然后再以5℃/min升至90℃，接着以12℃/min升至220℃，保留7min。

质谱条件：电离方式EI，进样孔温度250℃，离子源温度200℃，电子能量70eV，发射电流200μA，采集方式为全扫描，采集质量范围为m/z 33～495。

1.3.4.3 挥发性成分定性定量分析方法

GC-MS分析图经计算机和人工检索把每个峰同时与NIST Library和Wiley Library相匹配检索定性，匹配度和纯度大于900作为鉴定结果。峰面积表示物质相对含量。

1.3.5 数据分析与处理

实验中每个样品至少重复两次操作，测定所得的数据使用SPSS 16.0及Excel 2007进行分析。

2 结果与分析

面团发酵过程中，酵母主要起产气作用，乳酸菌则生成一些重要的香气化合物[14]。有报道指出新鲜酸面团添加量为2%～5%时面包具有更为丰富的风味[20]。Katina[21]研究表明，5%～40%添加量的酸面团面包风味取决于其酸化程度、游离氨基酸水平和重要风味化合物的含量。

2.1 旧金山乳杆菌酸面团发酵对面团中有机酸含量的影响

图1 旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对发酵面团中有机酸(乳酸、乙酸)含量的影响Fig.1 Effects of L.s. starters (SA and SW) on organic acids (lactic and acetic acids) contents in fermented doughs

图1显示了旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对面包发酵面团中乳酸和乙酸含量的影响。影响面团酸化的程度主要因素是体系中可发酵糖的含量，普通白面粉中游离糖很少(1.55%～1.84%)，而面粉中的内源性淀粉酶会提高初始麦芽糖水平10～15倍。α-淀粉酶活力取决于面粉的质量和出粉率，全麦粉中特别是麸皮中的酶活力最高[22]。

图中所示NHPD和NWPD中有机酸含量相差不多，添加L.s.酸面团发酵剂后，SWPD中的乳酸和乙酸含量皆高于SAPD，说明酸面团发酵在一定程度上增强了淀粉酶的活力。酸面团面包面团中有机酸含量高于相应的非酸面团面包面团，乳酸含量变化显著，说明旧金山乳杆菌发酵产酸作用明显，这对面包的香气有重要影响。

2.2 旧金山乳杆菌酸面团发酵对面团中游离氨基酸含量的影响

图2 旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对发酵面团中游离氨基酸总量的影响Fig.2 Effects of L.s. starters (SA and SW) on total content of free amino acids in fermented doughs

旧金山乳杆菌发酵产酸作用会使蛋白质降解，生成的游离氨基酸是重要的风味前体物质。而且，酸化过程为面粉中的蛋白酶发挥最大活力提供了适宜条件，从而强化了蛋白降解[21-23]。如图2所示，全麦面包面团中游离氨基酸总量显著高于普通面包面团，NWPD甚至高于SAPD，L.s.酸面团发酵剂的添加使其增量更加明显(SWPD)。谷物外皮层含有较高活力的天冬氨酸蛋白酶和一些其他谷物蛋白酶，因此全麦粉发酵会生成更多的氨基酸[24]。

2.3 旧金山乳杆菌酸面团发酵对面包中挥发性成分的影响

表2 不同面包中的挥发性成分Table 2 Volatile compounds and their relative area of different breads

续表2

影响面包风味的化合物主要是有机酸、醇、酯和羰基化合物等[13,25]，包括2-甲基丙酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁酸、2-壬烯醛、异戊醛、3-羟基-2-丁酮、糠醛和苯乙醇等[26]。面粉的种类影响面包的风味，使用高灰分面粉可以增加挥发性化合物的含量，因此全麦面包具有更浓郁的风味[27]。Czerny等[13]指出全麦粉与普通白面粉相比并未产生新的香气成分，而是改变了其中重要风味物质的含量。这与本实验结果相一致，表2中所列信息为从4种面包中检测得到的已知化合物及其相对含量。NSHB和NSWB含有45种挥发性成分，SSAB和SSWB含51种成分，全麦面包所含物质总含量大幅高于普通高筋粉面包(NSWB和SSWB较NSHB和SSAB而言分别提高了22.54%和26.58%)，其中重要的风味物质3-甲基-1-丁醇、3-羟基-2-丁酮、糠醛、3-甲基丁酸和苯乙醇含量均高于普通高筋粉面包，赋予全麦面包更为馥郁的麦芽香、奶香和清甜杏仁香气。这种积极作用在添加L.s.酸面团发酵剂后更为明显，SSAB和SSWB较NSHB和NSWB而言分别提高了11.31%和14.98%。乙酸、2-甲基丙酸和丁酸等具有刺激性酸味的化合物含量则有所降低。

旧金山乳杆菌酸面团发酵使面包(SSAB和SSWB)中挥发性化合物总量显著高于相应非酸面团面包(NSHB和NSWB)。乙酸、丁酸、戊酸以及2-甲基丁酸或3-甲基丁酸等是酸面团发酵过程中产生的重要风味活性化合物[13]。添加L.s.酸面团发酵剂后，面包中乙酸、丁酸和3-甲基丁酸含量均有所升高，戊酸只在全麦面包中检出且添加SW后含量降低。辛烷、对二甲苯、3-乙氧基-1-丙醇和1,3-丙二醇二乙酸酯仅存在于乳酸菌和酵母混合发酵的样品中。

内酯是一类重要的风味化合物[14]。由表2可知，L.s.酸面团发酵剂的添加对普通和全麦面包中内酯类物质(5-丁基-2(3H)-二氢呋喃酮、5-戊基-2(3H)-二氢呋喃酮、5-己基-2(3H)-二氢呋喃酮、6-戊基-2H-四氢吡喃-2-酮和5-庚基-2(3H)-二氢呋喃酮)的影响不尽相同。SA促进了这些内酯的生成，SW则使其含量减少。这使得SSAB更富于椰香和果样香气。

酸面团冻干后，其中的关键性风味物质含量会有所降低，通常干燥的酸面团更具麦芽和奶油香气，而新鲜酸面团的酸味更加明显[28]。因此，冻干的乳酸菌发酵剂不仅使用简便，还可以赋予面包更优良的风味。

3 结 论

冻干旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对发酵面团及其面包香气影响显著。酸面团面包面团中有机酸和游离氨基酸含量均高于相应的非酸面团面包面团，这在一定程度上影响了终产品面包中香气物质的形成；乳酸菌酸面团发酵显著提高了面包中挥发性物质的含量。全麦体系含有更多的游离氨基酸，其面包具有更浓郁的风味。L.s.酸面团发酵剂在不同面粉面团体系中产生的作用不同，SSAB含有较多的内酯类化合物，偏重于椰香和果样香气；SSWB含有更多的3-甲基-1-丁醇和3-羟基-2-丁酮，更富于麦芽香、奶香和清甜杏仁香气。本实验增进了对乳酸菌酸面团发酵技术的基础研究，为进一步开发具有特征性香气成分的发酵烘焙食品提供理论依据。

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Effects of Freeze-dried Sourdough Starters on Fermented Doughs and Bread Aroma

LIU Ruo-shi1，WAN Jing-jing1，HUANG Wei-ning1,*，LIU Gang2，RAYAS-DUARTE Patricia3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Hangzhou Zhiwei Foods Co. Ltd., Hangzhou 311107, China；3. Food and Agricultural Products Research Center, Oklahoma State University, Stillwater OK 74078-6055, USA)

Significant effects of freeze-dried Lactobacillus sanfranscensis (L.s.) sourdough starters on the aroma of common and whole fermented wheat doughs and breads were investigated using high performance liquid chromatography (HPLC) and solid phase micro-extraction/gas chromatography-mass spectrometry (SPME/GC-MS) analysis. Organic acids and total free amino acids contents in sourdough bread were higher than those in corresponding non-sourdough formulation. Volatile compounds concentrations were enhanced through lactic acid sourdough fermentation, with the increase of 11.31% and 14.98% from non-sourdough bread (NSHB) to L.s. sourdough bread (SSHB) and from non-sourdough whole wheat bread (NSWB) to L.s. sourdough whole wheat bread (SSWB), respectively. More free amino acids were detected in whole wheat fermented doughs, which endowed corresponding breads with more flavor. Total volatiles contents were raised by 22.54% and 26.58% from NSHB to NSWB and from SSAB to SSWB, respectively. Compounds positively correlated with bread aroma were 3-methyl-1-butanol, acetic acid, furfural, phenylethanol, 3-hydoxy-2-butanone, 3-methyl-butanoic acid, 3-methylbutanal and E-2-nonenal. The impacts of L.s. sourdough starters varied on different flours. SSAB contained more lactones whereas SSWB provided more 3-methyl-1-butanol and 3-hydoxy-2-butanone.

TS213.2

A

1002-6630(2011)07-0011-05

2010-08-11

国家农业科技成果转化基金项目(2009GB23600520)；美国农业部国际合作项目[A-(86269)]；国家“863”计划项目(2007AA100401)；国家自然科学基金项目(20576046)

刘若诗(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为烘焙科学、功能配料和食品添加剂。

E-mail：shishi1003@126.com

*通信作者：黄卫宁(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品烘焙与发酵技术、谷物食品化学。E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn

Key words：freeze-dried sourdough starter；Lactobacillus sanfranscensis；fermented dough；aroma；organic acid；free amino acid