张 宽,陈光达,许信刚,童德文

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)

细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。动物机体通过启动细胞凋亡机制来清除体内受损、衰老、突变和感染病原体的非正常细胞来维持机体动态平衡。这一过程涉及一系列复杂的蛋白激酶激活的级联反应,最终将凋亡信号传入细胞核,调节相关基因的表达,诱导细胞凋亡。日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染动物,会引起严重的脑炎症状,其发病机理可能与该病毒诱导细胞凋亡有关。JEV感染易感细胞后,引起细胞生长特性和形态学改变,最终死亡。已证明JEV感染细胞,通过激活细胞内凋亡机制致死细胞,被感染细胞发生染色质浓缩、DNA片段化,最终形成凋亡小体[1-2]。被感染的细胞发生典型的caspase级联反应以及NF-kappaB等因子的激活反应,同时一些凋亡调节蛋白在该过程中发挥着不同程度的调节作用。探明JEV与易感细胞之间的相互作用关系以及诱导细胞凋亡过程中的信号转导途径是研究JEV致病机制的基础,并且有助于日本脑炎防治药物的开发。

1 JEV结构特征

JEV属于黄病毒科黄病毒属,通过蚊虫叮咬传播,主要侵害中枢神经系统,临床上表现为发热、头痛、呕吐、脑膜炎症状,病死率极高,即使耐过也会留下严重的神经性后遗症,可以引起人严重脑炎[3]。与其他的虫媒传播的病毒一样,JEV传播受到昆虫媒介、脊椎动物宿主、被感染的人群以及周围环境等多种因素影响。在JEV的生活史中,人类是终末宿主,其他的脊椎动物(如猪等)是贮藏宿主。JEV是正单链RNA病毒,其RNA长度约为11 kb,包含一个开放阅读框,可编码一个多肽链。这个多肽链被加工成为3种结构蛋白(C、prM、E)和七种非结构蛋白(NS1-7)[4]。其中NS3蛋白是一个较大的多功能蛋白,包括蛋白酶活性、解旋酶活性以及5′三磷酸水解酶活性,基于这些功能,它在病毒的复制以及蛋白合成过程起重要作用[5]。JEV感染人后,主要在髓细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞上增殖。没有观察人感染JEV有病毒血症阶段,可能是因为该阶段非常短暂或者根本不存在。还没有证明JEV是否可以通过神经网络导致病毒从外周神经向中枢神经扩散。

2 JEV感染细胞并改变细胞生长特性

JEV诱导细胞凋亡主要由病毒粒子在细胞内大量复制引起。而JEV的非结构蛋白可以改变宿主细胞细胞膜的通透性,从而有助于JEV进入宿主细胞[6]。因为用UV处理JEV(UV-JEV),使其失去在细胞内复制能力同时保留与细胞上受体结合能力,不能再诱导BHK-21细胞系凋亡。然而,UV-JEV可以导致N18细胞系死亡。说明JEV可能是通过受体结合激活、或者是在细胞内复制、或者两种方式并存的途径诱导细胞死亡[7]。

JEV在细胞内增值会引起细胞发生一系列异常变化,其中之一是该病毒在细胞内增值可以将细胞周期抑制在G0/G1期。与其同科的登革病毒感染BHK-21和N18细胞后,明显将细胞周期抑制在G0/G1期。激活或者抑制细胞内调节周期的有关蛋白会打破细胞正常周期调控平衡,往往造成细胞死亡。细胞内的周期蛋白Cyclin A是调节细胞周期重要蛋白之一,它的表达量变化和重新分布部分参与细胞周期从G1期进入S期[8]。一些生长周期被抑制在G1期的细胞不再表达Cyclin A[9]。登革病毒感染BHK-21细胞系12h后即出现细胞周期被抑制在G1期,18 h后G1期细胞总量可达总细胞量的71.47%,而同时间段的对照组细胞没有发生明显的周期抑制,在感染18 h时,BHK-21细胞DNA出现异二倍体,说明此时细胞发生凋亡。以上现象说明,该病毒在细胞内增殖会改变细胞内周期蛋白的表达和分布从而将细胞生长周期抑制在G1期,继而诱导细胞发生凋亡[1]。

以前还没有证明细胞周期抑制到底是病毒在细胞内增殖所必须的条件,还是病毒在细胞内增殖对细胞造成的单方面损害。实验证明,JEV病毒可以在表达Bcl-2的BHK-21细胞系上正常增殖,病毒滴度不会受到影响的同时细胞正常分裂,并不产生病变[10]。可以说明,在该细胞系上周期抑制并不是病毒复制所必须的条件。仍然存在的问题是,病毒复制会造成细胞损伤,是抗凋亡蛋白阻止了病毒对细胞的损伤还是该蛋白赋予了细胞抗损伤的能力?

3 JEV诱导细胞凋亡的信号转导途径

3.1 线粒体信号转导途径

JEV诱导细胞凋亡途径之一是线粒体信号转导途径。JEV感染BHK-21和N18可以引起N18细胞色素C从线粒体释放,接着细胞色素C激活Caspase 9、Caspase 3。用环孢菌素和钌红可以减弱线粒体的破坏,用它们处理JEV感染的N18后,Caspase9、Caspase3激活受抑制[11]。值得一提的是,Caspase3并非JEV诱导凋亡所必需,JEV可以诱导不表达Caspase3的MCF-7凋亡,表现典型的凋亡特征,包括细胞色素C的释放、Caspase9、Caspase6、Caspase8的激活[12]。

JEV诱导细胞凋亡机制可能不通过死亡受体途径,或者该途径与其他途径并存发挥作用。细胞膜上有两类受体与细胞凋亡信号转到有关,分别是死亡受体(Fas)和肿瘤坏死因子受体一型(TNFR-1),分别通过胞浆结构域FADD和T RADD向细胞内部传导信号。死亡配体与死亡受体结合后可以激活死亡受体,从而胞浆面的FADD募集procaspase 8,形成死亡复合体,并激活Caspase8。FADD在死亡受体通路中起到非常重要的作用。如果将FADD突变,阻止死亡受体通路上的凋亡信号转导,不可以阻止JEV诱导细胞凋亡,也不能抑制Caspase 8的激活过程[11]。但是T RADD基因沉默后的细胞不能被JEV诱导凋亡,相应的caspase3也不能被激活,说明TRADD参与JEV诱导细胞凋亡的信号转导[13]。病毒感染细胞后,在细胞中大量复制,使细胞产生过量的ROS、线粒体内Ca2+浓度异常升高,继而导致线粒体膜电位降低、外膜通透性改变、PT孔开放,释放细胞色素C等激活Caspase级联反应,效应酶进入细胞核特异性作用于细胞DNA,将DNA切为200 bp左右的片段,最终细胞凋亡。

ROS在细胞凋亡信号转导通路中占有重要地位,从凋亡细胞中分离出来的线粒体可以产生过氧化物。作为凋亡抑制蛋白的Bcl-2在细胞内过表达时候可以抑制细胞色素C的释放和ROS的产生。UV-JEV感染细胞使细胞产生过量ROS,导致细胞死亡,这种死亡机制与Caspase和细胞色素C没有明显联系[14]。一些抗氧化剂如硫氧还蛋白、NAC、MnSOD,可以延缓细胞凋亡。硫氧还蛋白可以抑制ASK1的激活过程,而ASK1参与调节细胞凋亡过程中ROS介导的P38MAPK信号通路,故硫氧还蛋白间接抑制JEV诱导细胞凋亡[15]。

3.2 内质网信号转导途径

JEV在宿主细胞内增殖过程主要在胞浆,然后在细胞内部的膜结构上成熟,包括粗面内质网、高尔基复合体。可观察到在被JEV感染的细胞内部膜结构有上大量的病毒粒子堆积[16]。内质网不但是细胞蛋白质成熟加工的场所,它还是细胞内重要的信号传输中转站。其发挥功能的机制之一就是通过调节钙离子的释放而传输细胞受到的刺激信号。当细胞内部的动态平衡被打破时,内质网非常敏感,立即传输信号到胞浆和核,决定细胞是适应生存还是走向凋亡,这就是内质网应激(ERS)。电镜观察JEV感染的细胞有明显的内质网增生肥大,发生内质网应激[16]。

细胞受到不良刺激时,包括病毒感染,内质网发生的主要反应之一就是非蛋白折叠反应(UPR)激活一系列级联反应最终将信号传递到细胞核[17]。UPR以一些分子伴侣的表达提高为特征,包括葡萄糖调节蛋白(GPRs)、Bip/GRP78、GRP94等。此外,发生UPR后时,细胞内部蛋白翻译被全面抑制在起始阶段,从而降低内质网膜表面非折叠蛋白的堆积,缓解和修复细胞损伤。当细胞损伤过于严重或者急促,UPR不足以或者来不及修损伤,细胞就会激活凋亡机制[18]。发生ERs会引起与死亡相关的转录因子CHOP强表达,CHOP的过量表达可以使细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。过量表达并激活CHOP还会同时下调Bcl-2的表达和ROS的产生。ERs产生的凋亡信号会下传到细胞核,CHOP可能是UPR介导的凋亡信号通路中下游成员。JEV还可能通过内质网途径,在P38MAPK的参与下激活CHOP诱导细胞凋亡,因为p38MAPK可以增强CHOP的表达和激活。CHOP可能是Caspase级联反应的下游成员。因为JEV感染细胞会产生明显UPR并有CHOP和P38MAPK的激活[16,19]。P38MAPK在JEV诱导细胞凋亡信号通路中除了参与调节CHOP的表达激活外,起到关键性的信号转导作用,被感染的细胞中磷酸化P38MAPK的量高于正常细胞[20],加入P38MAPK抑制剂后,JEV诱导细胞凋亡率减少了33%[21]。

3.3 NF-κ B信号转导途径

NF-κ B是一种能与免疫球蛋白kappa链基因增强子κ B序列特异结合,并能促进kappa链基因表达的核蛋白因子。它广泛存在于真核细胞中,调节基因表达、细胞复制和存亡。NF-κ B活化过程未受到刺激时,在细胞中处于未活化状态,不具有调节基因转录的能力。当抑制NF-κ B磷酸化的蛋白Iκ B-α降解后,NF-κ B就可以被磷酸化激活,从胞浆复合物上解离进入细胞核,与细胞核内目的基因上的κ B元件结合,调节基因表达,调控细胞的调节细胞黏附、生长、复制、凋亡、免疫和胚胎发育。当病毒的衣壳蛋白与细胞的受体结合后,NF-κ B被激活,它对病毒诱导细胞凋亡有双重作用,这与病毒种类有关。对于有些病毒,如sindbis病毒和JEV,NF-κ B激活对病毒诱导凋亡有促进作用。病毒基因组启动子中有一个NF-κ B结合位点,当结合了NF-κ B后,病毒的致病性增强。试验证明,JEV感染细胞后,检测到激活的NF-κ B,当人为阻断NF-κ B的激活过程,JEV诱导细胞凋亡在一定程度上受到抑制。说明NF-κ B在JEV诱导细胞凋亡过程中起到关键作用[22]。

NF-κ B可能与细胞的抗病毒作用有关。在研究不同抗病毒药物作用机理时发现,不同药物的抗病毒机理不同。阿司匹林可以抑制病毒诱导的细胞凋亡,在药物作用下,细胞内NF-κ B激活过程同时受到抑制,说明该药物的抗病毒机制部分作用于细胞,并且调节NF-κ B的活性。而另一类药物水杨酸,可以抑制JEV诱导细胞凋亡,经检测,药物作用下细胞中的NF-κ B激活过程未受影响,同时JEV的毒力没有明显变化,说明水杨酸的抗病毒作用是通过与NF-κ B无关的一种单方面作用于细胞的机制发挥的[23]。

3.4 Bcl-2家族

Bcl-2家族在脊椎动物细胞凋亡信号转导通路中其重要的调节作用,目前还不断有新的该家族的成员被发现。Bcl-2家族蛋白结构中有四个保守结构域,称为Bcl-2同源结构域,分别是BH1、BH2、BH3、BH4在人类所知的所有的Bcl-2家族成员的蛋白结构中,都至少包含有一个Bcl-2同源结构域。Bcl-2家族既有抗凋亡成员也有促凋亡成员。在细胞凋亡、肿瘤生长、胚胎发育过程中起到调节作用。多数的抗凋亡成员都含有BH1和BH2,比较典型的代表是Bcl-XL,它同时包含有以上四个同源结构域,与Bcl-2非常相似。然而几乎所有的Bcl-2家族的成员都含有BH3,包括Bax、Bik和Bcl-Xs,其中Bcl-XL和Bcl-Xs由同一开放阅读框翻译的蛋白切割而成。

Bcl-2和Bcl-XL对于JEV诱导细胞凋亡调节作用研究相对较多,Bcl-2在线粒体信号转导通路中作用于线粒体外膜,抑制细胞凋亡。但是不参与死亡受体通路的调节。JEV感染不同细胞系,Bcl-2和Bcl-XL的作用不尽相同,提示JEV诱导不同细胞的凋亡途径略有差异。JEV诱导不同细胞凋亡形态学上相似,生化通路上有所区别。电镜观察感染JEV的细胞核发生异常变化,染色质浓缩边缘化和DNA片段化[24],而过表达Bcl-2的BHK-21细胞系感染JEV无此变化。这一现象表明,Bcl-2在BHK-21上表达可以抑制JEV诱导的凋亡。然而在N18细胞系上Bcl-2不表现此功能,它不能阻止或延缓JEV诱导N18凋亡[1]。可见,不同细胞中,Bcl-2发挥不同的调节功能,也就是说,它调节凋亡具有细胞特异性。即使是在同一细胞系,在不同刺激物作用下,Bcl-2的调节功能也不尽相同,辛德毕斯病毒感染或无血清培养基培养N18,Bcl-2表现有抗凋亡功能。另外,以上事实提示,Bcl-XL和Bcl-2可能分别在神经系统和外周组织细胞中发挥作用。JEV感染细胞后,不但会激活细胞内的凋亡信号通路,还会激活保护细胞不致死亡的PI3K/Akt信号通路。在凋亡早期,该信号通路有一定抑制凋亡作用,Bcl-2在该信号通路上游担任重要角色[25]。

4 结语

JEV感染细胞,既可以引起细胞凋亡,也可以导致细胞坏死[11]。但是,JEV感染细胞,在什么水平上可以诱导凋亡,在什么水平上可以导致坏死,二者是否与JEV感染的方式或者毒力有关,还有待于研究。JEV感染细胞产生CPE、诱导凋亡和坏死的信号转导通路还不明晰,仍存在一系列待解答的问题。JEV诱导凋亡的线粒体信号转导通路与内质网通路之间如何联系,在没有FADD参与下JEV仍然可以诱导细胞凋亡和Caspase级联反应,凋亡通路是仅由线粒体途径承担还是与死亡受体途径共同承担?JEV诱导凋亡检测到Caspase8激活,那么此处的Caspase8上游成员是谁,与ERs有怎样的联系?细胞内Caspase12的激活是JEV诱导细胞凋亡的上游因素还是仅仅是JEV引起ERs的一个与凋亡无关结果?JEV刺激激活的MAPK信号转导通路与JEV引起细胞CPE以及凋亡有怎样的联系?这些问题仍有待于深入研究探讨。

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