刘红芳

（长江师范学院，重庆 涪陵 408100）

茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是重庆市的特色农业资源，其加工产品“涪陵榨菜”蜚声海内外。在主产区涪陵，每年茎瘤芥种植面积约4万公顷，是该区农民增收的主要经济来源。危害茎瘤芥的病害主要有病毒病、根肿病、霜霉病和黑斑病等，这些病害严重影响榨菜生产的顺利进行，成为该产业发展的一大障碍。王旭祎等对病毒病、根肿病、霜霉病的发生、防治进行了相关研究[1-2]。但对茎瘤芥黑斑病的研究，至今未见相关报道。自2010年始,笔者对茎瘤芥黑斑病进行了病原菌生物学特性研究，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

从重庆市涪陵区农科所采集茎瘤芥黑斑病标本,在PDA培养基上用常规组织分离法获得纯培养后,再按柯赫氏法则接种进行致病性测定,对再次分离得到的病原菌据《中国真菌志——链格孢属》进行鉴定[2]。

1.2 茎瘤芥黑斑病菌生物学特性的研究

1.2.1 培养基对菌丝生长的影响选用PDA、PSA、玉米粉培养基、燕麦片培养基和Czapek培养基等5种培养基。取PDA上培养的菌种，分别放于5种培养基平板中央，25℃恒温培养，4次重复，直至生长最快的培养基中菌落直径接近9 cm时，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径。

1.2.2 营养生长及孢子形成（1）温度。PDA培养基接菌后分别置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培养箱中，每处理4次重复，直至生长最快的温度设置处理中菌落直径接近9 cm时，用十字交叉法测量菌落直径。培养10 d后，用直径7 mm的打孔器在距菌块中心1 cm处打取菌饼，置于10 mL无菌水中激烈振荡制成孢子悬浮液,滴4～6滴于载玻片上，在显微镜下镜检,每滴记5～8个视野内的孢子数，取其平均值（各处理随机抽取，1次重复）。以下各项实验控制温度为25℃，生长最快的处理中菌落直径接近9 cm时，用十字交叉法测量菌落直径，培养10 d后测产孢量（未标明处均为3次重复）。（2）pH值。用磷酸缓冲液将PDA培养基pH值调配为3、4、5、6、7、8、9、10、11。（3）光照。将接种后的PDA培养基分别置于日光灯下连续光照、12 h光暗交替、连续黑暗等条件下。（4）碳源利用。在Czapek培养基中分别以等量的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、木糖等与其中的蔗糖（CK）置换。（5）氮源利用。在Czapek培养基中分别以等量的硝酸钾、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氯化铵和硫酸铵等6种氮源与其中的NaNO3（CK）置换。

1.2.3 孢子萌发（1）温度。配制孢子悬浮液，分置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培养箱中，于4、8、12、24 h镜检孢子萌发率。以下各条件实验控制温度为25℃，24 h后镜检孢子萌发率（未标明处均为3次重复）。。（2）pH值。用磷酸缓冲液将孢子悬浮液pH值调配为3、4、5、6、7、8、9、10、11，每处理重复6次。（3）营养。设茎瘤芥浸渍液、1%葡萄糖液、无菌水等3个处理。（4）湿度。用浓硫酸在密闭的干燥器中调节湿度，自菌落上挑取少许孢子在载玻片上涂匀，将相对湿度控制在100%、98%、93%、90%、80%、75%、65%、50%。（5）光照。将孢子悬浮液滴一滴于载玻片上，分置于日光灯下连续光照、12 h光暗交替、连续黑暗等条件下。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离鉴定

对病叶进行组织分离培养后,将菌株回接到幼嫩的茎瘤芥（榨菜）叶上，均能产生典型的茎瘤芥（榨菜）黑斑病病斑，再次进行分离，挑取单孢纯化，获得病原菌。将分离、纯化得到的菌株在显微镜下观察,结果表明，病原菌菌株分生孢子梗单生或数根束生，暗褐色；分生孢子褐色或青褐色，圆筒形至椭圆形,具一短喙，3～6个串生，有纵隔膜0～4个，横隔膜3～8个，横隔处有缢缩现象。根据真菌分类鉴定，此病原菌为链格孢菌[3]。

2.2 茎瘤芥黑斑病菌生物学特性的研究

2.2.1 培养基对菌丝生长的影响在5种不同培养基上，病原菌均能生长，但在PDA和PSA培养基上菌落生长最好，其次为玉米粉、燕麦片和Czapek培养基（图1）。

图1 第五天时五种培养基菌落生长直径

2.2.2 营养生长及孢子形成（1）温度。不同温度下，病原菌的生长有极显著的差异。病原菌在25～30℃生长最快，为最适生长温度，25℃最适产孢，低于5℃或高于40℃，菌丝均不能生长（表1）。（2）pH值。病原菌在pH值3～11范围内均可生长，pH值6～8时生长较好，pH值5～7时适宜产孢，以pH值6最适（表2）。（3）光照。不同光照处理对菌丝的生长无显著影响，但在全光照处理下产孢量最多，其次是光暗交替处理；全黑暗处理产孢量最少，表明光照具有促进病原菌产孢的作用（表3）。（4）碳源利用。在不同碳源中，菌丝生长速度存在明显差异，以麦芽糖最为理想，其次为葡萄糖，木糖最差。在供试的碳源中，病原菌均可产孢，其中以麦芽糖最适，其次为葡萄糖，甘露糖最差（表4）。（5）氮源利用。病原菌对牛肉膏、蛋白胨和酵母膏的利用效果最好，其次为硝酸钾和硝酸钠，氯化铵和硫酸铵的利用最差。在供试的氮源中病原菌均可产孢，其中以牛肉膏、蛋白胨最适，其次为酵母膏，氯化铵最差。这说明病原菌对有机态氮和硝态氮利用效果好（表5）。

表1 不同温度对病原菌生长及产孢的影响

表2 不同PH值对病原菌生长及产孢的影响

表3 光照对病原菌生长及产孢的影响

表4 不同碳源对病原菌生长及产孢的影响

表5 不同氮源对病原菌生长及产孢的影响

2.2.3 孢子萌发（1）温度。温度对病原菌分生孢子的萌发率有较大影响。病原菌在10～35℃均能萌发，20～30℃是萌发的适宜温度区，低于10℃则分生孢子的萌发受到抑制，40℃条件下未见萌发（图2）。（2）pH值。分生孢子在pH值3～11时均能萌发,在pH值6～7时24 h萌发率达到80%以上,其余均不足50%。pH值为3和11时，萌发率较低，24 h仅30%萌发（图3）。（3）营养。分生孢子在茎瘤芥叶片浸渍液、1%葡萄糖液和无菌水中均能萌发。在茎瘤芥叶片浸渍液和1%葡萄糖液中萌发率均高于无菌水中的萌发率，但分生孢子的萌发率差别不大（图4）。（4）湿度。分生孢子萌发对相对湿度的要求非常严格，RH在90%以上时孢子才能萌发，最适RH为98%～100%，当RH<90%时，孢子不能萌发，当RH为100%时，萌发率达到最大值97%（图5）。（5）光照。通过全光照、12 h光照12 h黑暗和无光照的培养,结果表明:全光照处理孢子萌发率最高,达95.6%；其次是光暗交替处理，孢子萌发率为93.8%；全黑暗处理孢子萌发率为89.7%，明显低于前两者。这表明光照具有促进病原菌分生孢子萌发的作用（图6）。

图2 温度对病原菌分生孢子萌发的影响

图3 pH值对病原菌分生孢子萌发的影响

图4 营养对病原菌分生孢子萌发的影响

图5 湿度对对病原菌分生孢子萌发的影响

图6 光照对病原菌分生孢子萌发的影响

3 小结

链格孢菌为一类寄主范围较广的病原菌,人们对该类病原菌的生物学特性研究的较多[4-6]。本文针对茎瘤芥（榨菜）黑斑病病原菌的生物学特性进行了研究，确定该病原菌最适生长培养基为PDA培养基和PSA培养基；最适生长温度为25～30℃；最适生长pH值为6～8；光照对病原菌的生长无明显影响，但在全光照处理下产孢量最多；麦芽糖为最适产孢的理想碳源，病原菌对有机态氮和硝态氮利用效果较好。分生孢子萌发的最适温度为20～30℃，最适pH值为6～7，最适RH为98%～100%，在1%葡萄糖液、水及茎瘤芥（榨菜）叶片浸渍液中萌发均较好，光照具有促进病原菌分生孢子萌发的作用。这一研究结果为进一步了解茎瘤芥（榨菜）黑斑病的发生规律和病害的防治提供了一定的理论依据。下一步的工作，应继续进行病情调查及病害发生规律和流行趋势的观察,并对该病害进行药剂和生防菌的筛选，以便提出综合防治措施。

[1]王旭祎，徐兴慧.涪陵茎瘤芥主要病害的发生与防治[J].长江蔬菜，2005，30-31.

[2]何士敏，向倩，周先容.茎瘤芥种子萌发期过氧化物酶的研究[J].安徽农业科学，2009，37（3）:951-955，989.

[3]张天宇.中国真菌志——链格孢属（第十六卷）[M].北京:科学出版社，1998.

[4]王连平，王汉荣，茹水江，等.浙江省番茄早疫病菌生物学特性研究[J].浙江农业学报，2002，14（6）:320-325.

[5]杜云安，王朝晖，梁继华，等.几种药剂防治香蕉叶斑病效果比较[J].安徽农业科学，2009，（27）:13131-13131，13191.

[6]刘开智，梅正鼎，王洪.细极链格孢菌蛋白激发子对棉花种子萌发及幼苗生长的影响[J].湖南农业科学，2010，（7）:13-14，17.