芦 珂，廖婷彬

（1.四川省雅安职业技术学院药学检验系，四川 雅安 625000；2.四川养麝研究所，四川 都江堰 611800）

本试验观察了天府肉鸭采食含铜100mg/kg以上的高铜日粮时红细胞免疫功能的动态变化，旨在揭示铜对红细胞免疫功能的影响规律，同时初步探讨了高铜对红细胞免疫功能的影响机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物和日粮

1.1.1 试验动物 选用1日龄天府肉鸭健雏300只随机分成6组，每组50只（其中30只定期剖杀作血液生化指标的动态观察），平均体重为52～60g/只。各组雏鸭分别饲养于木制实验禽笼内，自由采食，饮用去离子水。管理方式与常规育雏一致，试验期为6周。

1.1.2 试验日粮 玉米－豆粕型基础日粮（含Cu 8 mg/kg）作为对照组日粮，在对照组日粮中分别添加Cu 92mg/kg、192 mg/kg、392 mg/kg、592 mg/kg、792 mg/kg构成高铜日粮I组（Cu 100mg/kg）、II组（Cu 200mg/kg）、Ⅲ组（Cu 400mg/kg）、Ⅳ组（Cu 600mg/kg）、Ⅴ组（Cu 800mg/kg）。其中蛋白质含量、能量以及维生素和微量元素（铜除外）添加量均参照肉鸭NRC（1994）的营养标准。铜源为CuSO4·5H2O晶体(饲料级)。试验日粮组成和营养成分详见表1。

1.2 红细胞免疫功能测定 于试验的第7d、35d，从各组随机抽取4只肉鸭作颈静脉采血，肝素钠抗凝，用红细胞C3b花环和红细胞免疫复合物（IC）花环实验来检测红细胞的免疫功能（郭峰，1982）。测定用的冻干酵母菌购于上海某医院免疫室。

表1 试验日粮组成和营养成分

1.3 RBC－C3bRR实验 取新鲜肝素抗凝全血0.1～0.5 mL，加等量生理盐水稀释，用Ficoll分离液水平离心除去其他血细胞。取沉底的红细胞，用生理盐水洗3次，每次2000r/min离心5min。记数后配成每1mL含1.25×108个细胞的红细胞悬液。将洗涤3次后的1%酵母悬液经定性滤纸过滤，恢复原体积，煮沸20min。充分混匀洗涤2次，使其在低倍显微镜下呈单个细胞分散状态。加等量鸭血清，37℃水浴15min，用生理盐水混匀，洗涤，离心1次，配成1×108个/mL C3b致敏酵母悬液。用5号针头滴管取红细胞悬液5滴，加C3b致敏酵母悬液2滴，在试管内充分混匀，37℃水浴30min，加10滴生理盐水稀释混匀，再加0.25%戊二醛2滴固定，涂片，冷风吹干，用瑞氏－姬姆萨染液染色，镜检。镜下酵母菌呈淡蓝色，红细胞呈红色，白细胞呈深蓝色。高倍镜或油镜下计数200个红细胞，红细胞黏附2个或2个以上的酵母菌为一个花环形成细胞，计数算出花环阳性细胞百分率，即为红细胞免疫黏附活性指标。

1.4 RBC－ICR实验 心血提取红细胞同上，煮沸酵母菌同上，但不加鸭血清致敏。5滴红细胞悬液加5滴煮过的酵母菌，摇匀，置37℃水浴30min，取出用适量的生理盐水混匀后，再加0.25%戊二醛2滴摇匀，水平涂片，固定，染色。镜下计数，以红细胞黏附2个或2个以上酵母为一个花环形成细胞，计数200个红细胞，算出花环阳性细胞百分率，即为RBC－IC花环率（ICR）。

1.5 数据处理 用SPSS统计软件分析测定结果，确定组间差异显著性。

2 结果

红细胞C3bR花环和IC花环的形态如下图所示：

2.1 红细胞C3bR花环率变化 1周龄时，各试验组随铜剂量升高C3bR花环率不同程度地依次降低，对照组的C3bR花环率最高，其中3个高铜试验组（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。5周龄时，Ⅰ组C3bR花环率低于第Ⅱ组，其余各试验组的C3bR花环率随着铜剂量的升高而降低，Ⅴ组与对照组比较差异显著（P＜0.05）。详情见表2，图1。

表2 雏鸭红细胞C3bR花环率 %

表3 雏鸭红细胞IC花环率 %

2.2 红细胞IC花环率变化 1周龄时，各试验组随铜剂量升高IC花环率不同程度地依次降低，对照组的IC花环率最高，其中第Ⅴ组与对照组比较差异极显著（P＜0.01），Ⅳ组与对照组比较差异显著（P＜0.05）。5周龄时，各试验组的IC花环率随着铜剂量的升高呈先升高后降低的态势，Ⅰ组与Ⅲ组比较差异显著（P＜0.05）。

3 讨论与结论

3.1 本试验结果表明，高铜可导致雏鸭C3bR花环率下降，且饲料中铜的含量越高，C3bR花环率的下降辐度越大。说明当饲料中铜含量超过200mg/kg后，RBCCR1花环率与饲料铜含量之间存在着负相关。根据红细胞C3bR花环和IC花环的形成原理（在花环形成前还处于未结合状态的CR1在C3bR花环形成过程中发挥作用），说明此结果反映了红细胞上处于未结合状态的CR1数量，而CR1是先通过C3b与IC结合，处于结合状态后，连接于CR1的C3b再与酵母菌黏连形成IC花环，故IC花环率显示了结合状态的CR1数目。

3.2 本试验结果表明，高铜导致雏鸭红细胞IC花环率1周龄时降低；5周龄时，随着饲料铜剂量的升高，IC花环率先升高后降低。Forslod（1982）认为，红细胞内含有高浓度过氧化氢酶及超氧化物歧化酶，能清除吞噬过程中产生的氧化代谢产物，从而促进吞噬作用。笔者认为，在巨噬细胞吞噬红细胞上免疫复合物（IC）的过程中所产生的自由基，不仅仅只依赖于红细胞内过氧化物酶的清除，作为清除红细胞上IC的主要场所，肝、脾内过氧化物酶活性的改变同样会影响巨噬细胞功能的正常发挥，使其不能将IC有效清除，因此IC花环率升高。本研究中IC花环率升高的结果提示：高铜可能导致雏鸭肝脾等参与红细胞上IC清除的主要器官的功能出现异常。

有报道指出，红细胞的免疫功能同时受红细胞免疫调节因子、白介素等细胞因子和神经内分泌系统等多种因素的影响，因此高铜对红细胞免疫黏附能力的影响机制可能更为复杂，有待进一步深入探讨。缺铜对动物生长发育和免疫功能的影响已引起了广泛关注，目前高铜添加剂越来越受到人们青睐，且添加量有越来越多之势，以致铜在畜禽机体组织中的残留到了令人担忧的地步。本试验结果表明，饲料铜含量在200mg/kg即可导致红细胞免疫功能下降，所以补铜必须慎重，防止过量补铜对动物机体产生毒副作用。

[1] Siege I.Hypothesis the red cell immune system[J].Lancet，1981，2：556－559.

[2]刘 辉，周 迪，牛钟相，等.红细胞免疫的研究进展[J].动物科学与动物医学，2002，19（2）：23－25.

[3]崔恒敏，陈怀涛.动物红细胞免疫功能的研究进展[J].中国兽医科技，2003，33（5）：23－27.

[4]张德成，陈思义，李进昌，等.动物红细胞免疫功能的研究[J].畜牧兽医学报，1992，23（3）：285－288.

[5]王旭东，饶家荣，李正甫，等.11类哺乳类和鸟类动物红细胞免疫功能的对比研究[J].畜牧兽医学报，1995，26（6）：524－529.

[6]崔恒敏，彭 西，黎德兵，等.高锌对雏鹅红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医学报，2004，24（6）：576－578.

[7] Bonham M，O′connor J M，Hannigan B M，et al.The immune system as a physiological indicator of marginal copper status[J].Br.J.Nutr.，2002，87：393－403.

[8]柴春彦，石发庆，刘国艳，等.摇摆病奶牛体内铜状态及其与NO水平的关系 [J].黑龙江畜牧兽医，2001，（7）：1－3.

[9]史志诚.动物毒物学[M].北京：中国农业出版社，2001.

[10]郭 峰，等.红细胞免疫功能初探[J].中华医学杂志，1982，62：715－716.

[11]王旭东，饶家荣.北京鸭红细胞免疫功能初探[J].北京兽医杂志，1994，20（4）：6－7.

[12]庞训胜，陈 龙，殷定忠，等.雏鸡红细胞免疫功能发育变化及日粮添加免疫生长促进剂对其的影响[J].中国畜牧杂志，1999，355（3）：37－38.