李潇 孙钦峰 孙允东 葛少华 杨丕山

（1.山东大学口腔医院 牙周科，山东省口腔生物医学重点实验室；2.山东大学医学院 医学微生物学教研室，济南 250012）

侵袭性牙周炎与慢性牙周炎病变位点中人巨细胞病毒的定量检测

李潇1孙钦峰1孙允东2葛少华1杨丕山1

（1.山东大学口腔医院 牙周科，山东省口腔生物医学重点实验室；2.山东大学医学院 医学微生物学教研室，济南 250012）

目的 应用实时荧光定量PCR方法检测侵袭性牙周炎（AgP）及慢性牙周炎（CP）患者龈下样本中人巨细胞病毒（HCMV）的DNA载量，探讨HCMV感染与牙周炎之间的关系。方法 选择18例AgP患者、24例CP患者及15例牙周健康对照者，收集龈下样本114例。构建含有HCMV高保守片段的重组质粒，制备标准品DNA模板，建立并应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，检测样本中HCMV的DNA载量。结果 AgP病变位点、CP病变位点以及牙周健康位点中HCMV的阳性检出率分别为58.3%、41.7%和6.7%。AgP和CP病变位点中HCMV的阳性检出率显著高于牙周健康位点（P＜0.01）。在AgP病变位点中，病毒载量在104以上的位点占33.3%，明显高于CP病变位点的10.4%，两组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 HCMV感染与牙周炎的发生发展密切相关，其活动性感染可能与AgP组织破坏的迅速进展有关。

人巨细胞病毒； 侵袭性牙周炎； 慢性牙周炎

牙周炎是一种慢性感染性疾病，其发生发展受到多种因素的影响。存在于菌斑生物膜中的牙周可疑致病菌及其产物是引发牙周疾病的始动因子。然而，单纯的细菌感染学说不能很好地解释牙周组织破坏局限化及阵发性破坏加速等现象。近年来，学者[1]提出某些疱疹病毒可能与牙周炎的发病有关，牙周局部组织的疱疹病毒感染可以在一定程度上解释牙周炎的某些临床表现。其中，人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）被认为是与牙周炎关系最为密切的一种疱疹病毒。由于不同种族人群病毒感染情况存在差异，以及研究者选用的检测方法不同，导致各研究机构的HCMV检测结果存在较大差异[2-3]。HCMV与牙周炎之间的关系尚存在争议，需要进一步研究探讨。侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）和慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是临床表现和实验室检查均有明显差异的2种牙周炎[4]，HCMV DNA载量在AgP和CP的病变位点中是否存在差异目前尚未明确。本实验应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，对AgP及CP病变位点的龈下样本进行HCMV定量检测，旨在进一步探讨HCMV与这2种不同类型牙周炎之间的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

依据1999年牙周病分类法国际研讨会对AgP及CP所制定的诊断标准[5]，在山东大学口腔医院牙周科就诊的初诊患者中选择AgP及CP患者共42例。其中AgP患者18例，年龄19～35岁，男8例，女10例；CP患者24例，年龄41～65岁，男15例，女9例。15例牙周健康对照者来自山东大学口腔医院职工和来牙周科常规检查的志愿者，年龄22～45岁，男7例，女8例。所有受试者的共同纳入要求为：1）无明显的错畸形，余留牙不少于20颗；2）近1年内未接受过牙周治疗，3个月内未服用过抗生素；3）全身无糖尿病、心血管疾病等系统性疾病，女性非妊娠期或哺乳期；4）无吸烟史。健康对照者全口牙周检查探诊深度（probing depth，PD）小于等于3mm，无附着丧失（attachment loss，AL），出血指数（bleeding index，BI）大于等于2的位点不超过10%。

本研究经山东大学口腔医院伦理委员会批准，受试者均知情同意。

1.2 临床观察指标

检查并记录所有受试者的全口牙周状况，包括菌斑指数（plaque index，PLI）、PD、AL、BI、松动度以及根分叉病变情况，并拍摄全口曲面断层片。

1.3 龈下标本的采集与处理

牙周炎患者各以2颗病变较重的磨牙为观察牙，选择其探诊深度最深的位点作为取样位点，取样位点排除颈部龋坏及充填体等局部刺激因素，并满足PD大于等于5mm，AL大于等于3mm，探诊出血（＋）。健康对照者选择2颗第一磨牙的近中颊侧位点为取样位点，要求PD小于等于3mm，无附着丧失，探诊出血（－）。采用无菌刮治器收集龈下菌斑样本，将取样位点隔湿后，先用消毒棉球将龈上菌斑清除，并用气枪吹干牙面，用无菌刮治器从取样位点牙周袋最底部刮取龈下菌斑，置于EP管中，加入200μL TE缓冲液，充分振荡混匀，-80℃冰箱保存备用。收集的龈下样本共114例。

1.4 龈下样本DNA抽提

采用小量病毒核酸抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）抽提样本DNA。紫外分光光度计检测DNA质量浓度和纯度，所有样本DNA质量浓度统一稀释至100 ng·μL-1，-20℃保存备用。

1.5 标准品来源

HCMV由山东大学医学院微生物学教研室提供，用作阳性标准品样品；EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）及牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）标准菌株分别由青岛大学医学院微生物学教研室和四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供，以上病原体均作为特异性实验阴性对照品，DNA抽提同1.4所述。

1.6 标准品DNA模板的制备

选取HCMV高保守序列设计特异性引物[6]，正链引物序列为5’-GCGTGCTTTTTAGCCTCTGCA-3’，负链引物序列为5’-AAAAGTTTGTGCCCCAACGGTA-3’，由上海博尚生物技术有限公司合成。以HCMV DNA为模板行常规聚合酶链反应（poly-merase chain reaction，PCR），扩增所得的151 bp特异性片段克隆于pMD19-T载体（TaKaRa公司，日本），重组质粒经PCR鉴定后送交测序。用高纯质粒小量制备试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）纯化质粒DNA，紫外分光光度计定量后换算为拷贝数，连续10倍梯度稀释，制备（1×100～1×108）copies·mL-1的标准品DNA模板，建立HCMV的定量标准。

1.7 荧光定量PCR反应体系的建立

采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，反应体系使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂。反应总体积20μL，其中样品DNA模板2μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，正负链引物（5μmol·L-1）各0.8μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，灭菌去离子水补齐20μL反应体系。使用ABI7000荧光定量PCR仪进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，62℃退火31 s，共40个循环。循环结束后附加熔解曲线分析。敏感性、特异性及稳定性检测：分别取（1×100～1×108）copies·mL-1的阳性标准品DNA 2μL，按上述条件进行敏感性检测；以龈下样本中常见的病原体HCMV、EBV、P.gingivalis、F.nucleatum以及正常人基因组的DNA为模板，按上述条件进行特异性检测；选择3个低浓度的阳性标准品DNA为模板，批内及批间各重复检测3次，以评价该反应体系的稳定性。

1.8 龈下样本的检测

将待测龈下样品DNA模板和标准品在同一定量PCR体系中完成检测。根据出现S型扩增曲线及循环阈值（Ct值）小于等于37判断阳性结果，根据熔解曲线峰值判断是否为特异性扩增，由ABI7000 Real-Time PCR System随机软件自动生成模板浓度（Log C0）与曲线Ct值之间的标准曲线，并依据标准曲线自动给出每个样本的DNA拷贝数。

1.9 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，检出率采用卡方检验。

2 结果

2.1 阳性标准品DNA模板的获得

成功克隆并获得含有目的片段的重组质粒，测序结果正确，可用作阳性标准品DNA模板。

2.2 反应敏感性、特异性及稳定性检测

敏感性检测结果表明：随着模板量的梯度减少，扩增曲线的Ct值逐渐增大，检测的底线为1×102copies·mL-1。特异性检测结果表明：HCMV阳性模板可见阳性扩增曲线，熔解曲线分析可见在87℃附近有一特异性峰值，EBV、P.gingivalis、F.nucleatum以及正常人基因组DNA均未见阳性扩增曲线，熔解曲线分析见以上阴性对照均显示为一条低平无峰曲线。稳定性实验结果表明：浓度分别为（1×102～1×104）copies·mL-1的标准品模板批内及批间Ct值的变异系数均小于5%。

2.3 实时荧光定量PCR标准曲线分析

标准曲线分析结果（图1）显示：HCMV标准品Log C0与Ct值之间具有良好的线性关系（R2＞0.99）。

图1 HCMV实时荧光定量PCR标准曲线Fig 1 Standard curve for HCMV fluorescent quantitative realtime PCR

2.4 龈下样本实时荧光定量PCR检测结果

实时荧光定量PCR检测结果显示：AgP病变位点、CP病变位点以及牙周健康位点中HCMV的阳性检出率分别为58.3%、41.7%和6.7%（表1）。AgP和CP病变位点中HCMV的阳性检出率显著高于牙周健康位点（P＜0.01），而AgP病变位点与CP病变位点之间无统计学差异（P＞0.05）。HCMV载量在不同类型牙周位点中的分布情况见表1、2，在AgP病变位点中，病毒载量在104以上的位点占33.3%（12/36），明显高于CP病变位点的10.4%（5/48），两组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 牙周炎病变位点和牙周健康位点中HCMV阳性检出率及病毒载量范围Tab 1 Prevalence and quantity of HCMV in periodontitis sites and healthy controls

表2 HCMV载量在牙周炎病变位点和牙周健康位点中的分布情况Tab 2 Distribution of HCMV load in periodontitis sites and healthy controls n/%

3 讨论

HCMV初次感染后，通常以无症状状态潜伏在健康人体中，在一定条件下，病毒激活并增殖，释放病毒颗粒，损伤机体细胞并改变细胞的炎症反应模式，继而引起症状。HCMV的这种致病模式与牙周炎呈阵发性破坏加速的特点十分相似，所以近年来愈来愈受到牙周病学领域专家及学者的关注[1-3]。病毒载量的高低直接关系到此病毒在疾病中的致病效应及疾病的严重程度，因此对牙周病变位点中的HCMV进行定量检测，可以更深入地了解病毒与牙周病之间的关系。

以SYBR GreenⅠ作为荧光指示剂的实时荧光定量PCR方法是近年才发展成熟的一种病毒检测方法，现已广泛应用于病毒DNA或RNA载量的检测[7]。本研究以HCMV高保守序列为靶基因设计特异性引物，并对引物浓度及退火温度等扩增条件进行优化，消除了引物二聚体对结果的影响，建立了一种适用于检测牙周标本中HCMV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。特异性检测结果显示：除HCMV阳性标准品出现扩增曲线和特异性溶解曲线峰外，其他在牙周病变位点中常见的病毒及细菌DNA均表现为阴性结果。敏感性检测结果显示：随着模板量的梯度减少，扩增曲线的Ct值逐渐增大，检测底线为1×102copies·mL-1。稳定性实验结果显示：该方法批内和批间的Ct值变异系数均小于5%。以上结果说明本研究建立的方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，能够满足少量牙周龈下标本中HCMV的检测，为临床大样本深入研究HCMV在牙周炎发病中的作用奠定了实验基础。

AgP在好发人群、病因及临床表现等方面均不同于CP[4]。AgP以发病年龄低、病程进展迅速为特点，并可造成严重的牙周附着丧失和牙槽骨破坏。其病因非常复杂，除细菌感染、遗传因素、宿主免疫状态外，病毒感染也可能起到一定作用。本研究检测结果显示：与牙周健康位点相比，AgP和CP病变位点中均有较高的HCMV阳性检出率，这说明HCMV感染与牙周炎的发生发展密切相关。而Nibali等[3]采用荧光定量PCR方法在牙周炎患者龈下标本中未检测到HCMV，因而对HCMV在牙周炎中的致病作用提出质疑。分析导致各研究机构HCMV检测结果之间存在较大差异的原因可能与不同国家人种、生活习惯以及采用的检测方法不一致有关。重要的是，本研究发现；虽然AgP与CP中HCMV的检出率无明显差异，但二者的HCMV DNA载量存在明显不同。AgP患者病变位点中的HCMV载量可高达1.62×105copies·mL-1；高拷贝的病毒DNA检出率显著高于牙周健康位点，也明显高于慢性牙周炎病变位点。Botero等[2]发现：大部分病程进展缓慢的慢性牙周炎病变位点处于HCMV的潜伏感染状态而不是病毒的活动性感染。Ting等[8]研究显示：在5例X线片表现为硬骨板消失的局限型侵袭性牙周炎病变位点中全部可以检测到HCMV主要衣壳蛋白转录产物的cDNA，从而认为HCMV的活动性感染在局限型AgP的活动性病变中扮演了重要角色。Kamma等[9]也发现HCMV感染与处于维护期治疗的AgP活动性位点相关。丁芳等[10]也通过研究证明AgP患者HCMV检出率显著高于健康对照者，提示龈下疱疹病毒的存在与侵袭性牙周炎相关。本研究结果与上述研究相符，并进一步通过定量检测的方法比较了AgP与CP病变位点之间的病毒拷贝水平，结果提示：在AgP的病变位点中，HCMV处于活跃的增殖状态，HCMV的活动性感染可能与广泛型AgP牙周组织破坏的迅速进展密切相关。HCMV活动性感染与AgP进展相关可能与以下因素有关：1）HCMV的活动性感染可能导致牙周组织局部短暂的免疫抑制，使宿主对牙周致病菌的抵抗力下降，从而导致牙周可疑致病菌的大量繁殖，加速了牙周组织破坏的进程；2）HCMV活跃增殖可能直接破坏牙周组织细胞；3）HCMV可能通过诱导能够激活破骨细胞和基质金属蛋白酶的促炎症因子的释放，进一步加重牙周组织的破坏。但是，AgP病变位点中高拷贝HCMV活跃增殖的具体机制目前尚不明确，患者个体因素、局部及全身的T细胞免疫状况是否在其中起到作用还有待进一步证实。

本研究表明：HCMV感染与牙周炎发生发展密切相关，其活动性感染可能与AgP牙周组织的快速破坏有关。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性和灵敏性，可以用于HCMV与牙周炎发生发展关系的临床大样本研究。

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（本文编辑 李彩）

Quantitative detection of human cytomegalovirus in aggressive and chronic periodontitis lesions

LI Xiao1,SUN Qin-feng1,SUN Yun-dong2,GE Shao-hua1,YANG Pi-shan1.（1.Dept.of Periodontics,School of Stomatology,Shandong University;Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine,Jinan250012,China;2.Dept.of Microbiology,School of Medicine,Shandong University,Jinan250012,China）

ObjectiveTo establish a quantitative real-time PCR assay for the detection of human cytomegalovirus（HCMV）DNA load in subgingival specimens from the patients with aggressive and chronic periodontitis,and to investigate the relationship between HCMV infection and the periodontal status.MethodsA total of 114 subgingival plaque specimens were taken from 18 subjects with aggressive priodontiti（AgP）,24 subjects with chronic periodontitis（CP）and 15 healthy control subjects.Standard quantification was performed with recombinant plasmid containing a conserved fragment of HCMV.The SYBR GreenⅠfluorescent quantitative real-time PCR assay was established based on positive plasmid.HCMV DNA load in the specimens were detected with quantitative real-time PCR based on SYBR GreenⅠfluorescence.Results HCMV were detected in 58.3%of AgP sites and 41.7%of CP sites,however, only 6.7%of periodontally-healthy sites were HCMV positive.The detection rate of HCMV in periodontitis lesions was significantly higher than in periodontal health（P＜0.01）.High copy-counts more than 104of HCMV were detected in 33.3%of AgP sites,which were significantly higher than in CP sites（10.4%）（P＜0.05）.ConclusionSubgingival infection with HCMV is closely associated with periodontitis.Active HCMV infection may be related to the rapid tissue destruction of AgP.

human cytomegalovirus； aggressive periodontitis； chronic periodontitis

R 781.4＋2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.005

1000－1182（2011）03－0242-04

2010-09-23；

2010-11-10

李潇（1984—），女，山东人，硕士

杨丕山，Tel：0531-88382368