尹柏双,李静姬,呼显生,崔永镇,沙万里

(1.吉林农业科技学院动物医学学院,吉林长春 132101;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨 150001)

生物体内的微量元素、维生素在清除自由基的过程中发挥着重要的生理功能,微量元素铜(Cu)、锌(Zn)、硒(Se)、锰(Mn)、铁(Fe)是某些抗氧化物酶的主要构成成分,发挥抗氧化作用;维生素A、维生素C、维生素E具有抗氧化作用,是生物体内良好的自由基清除剂[1]。文献报道,自由基蓄积与炎症反应关系密切[2],而抗氧化剂可以清除自由基,势必有减轻炎症的作用。饲料中添加微量元素可减少疾病的发生[3]。据报道日粮中添加Se可以增强乳腺组织的抗感染能力并减少乳房炎的发生[4];相反,日粮缺Se可导致奶牛乳腺组织内嗜中性粒细胞的杀菌活性下降[5]。见于自由基-抗氧化物酶-抗氧化剂三者之间的密切关系,本文对泌乳期患病奶牛血清抗氧化剂含量变化进行分析,探讨奶牛乳房炎发病与抗氧化剂的关系。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选择产奶量、胎次和泌乳期相近,营养中等怀孕黑白花奶牛,健康组(对照组)7头,乳房炎组7头,对照组与乳房炎组饲养管理条件完全相同(吉林市春光奶牛场提供)。

1.2 主要试剂 维生素E测试盒、维生素C测试盒,均购于南京建成生物工程研究所。铜、锌和硒国家标准溶液(质量浓度为1 000 mg/L),购于北京化工冶金研究院 。

1.3 主要仪器 PEAA-800原子吸收光谱(原子化器石墨炉);Digestor 2020消化炉;铜、锌、硒空心阴极灯。

1.4 样品的采集与处理 试验动物分别于泌乳后1、7、14 、21、28、35 d 和 42 d 颈静脉采血 ,室温下自然凝固1～2 h,冰浴30m in,然后3 000 r/min离心10 min,分离血清,置-20℃冰箱中保存备用。

取血清1m L置于100m L消化管中,放入玻璃珠,加混酸(硝酸与高氯酸体积比4∶1)10m L放置过夜,次日将消化管置消化炉上消化,逐渐加热产生白烟,消化液呈无色透明或略带黄色,冷却后用滴管将样品消化液过滤入25m L容量瓶中,用去离子水少量多次洗涤消化管,洗液合并于容量瓶中定容至刻度,混匀备用。

1.5 血清维生素E和维生素C的检测 维生素E含量和维生素C含量测定:化学比色法(具体操作方法参照各测试盒说明书)。

1.6 血清硒含量测定 石墨炉原子吸收分光光度法,Se空心阴极灯下测定Se浓度。仪器工作条件:波长196.0 nm,光谱通带0.4 nm,灯电流 15 mA,石墨炉升温程序,见表1。

表1 石墨炉升温程序

计算公式为CX=(C1-C0)/m×稀释倍数式中:CX为样品元素的质量浓度(mg/L);C1为仪器所测样品质量浓度值;C0为仪器所测样品空白值;m为样品体积或质量。

1.7 血清铜、锌含量测定 设置好分析条件后,将标准应用液系列、空白液、样品液分别导入原子吸收火焰,在Cu、Zn空心阴极灯下测定Cu、Zn浓度。原子吸收分光光度仪工作条件见表2。

表2 仪器工作条件

计算公式为CX=(C1-C0)/m×稀释倍数式中:CX为样品元素的质量浓度(mg/L);C1为仪器所测样品质量浓度值;C0为仪器所测样品空白值;m为样品体积或质量。

2 结果

2.1 奶牛血清维生素E含量的变化 乳房炎组奶牛血清维生素E含量在泌乳各时期均显著降低,与对照组比较差异极显著(P＜0.01),结果如表3所示。

表3 奶牛血清维生素E含量的变化(±S) (μg/m L)

表3 奶牛血清维生素E含量的变化(±S) (μg/m L)

*:组间差异显著(P＜0.05);**:组间差异极显著(P＜0.01),下表同

泌乳日数(d) 1 7 14 21 28 35 42对照组 2.78±0.34 3.22±0.32 3.36±0.24 3.63±0.21 3.65±0.31 3.63±0.28 3.74±0.25乳房炎组 1.67±0.26** 2.04±0.43** 2.17±0.28** 2.24±0.39** 2.31±0.32** 2.23±0.23** 2.32±0.21**

2.2 奶牛血清维生素C含量的变化 乳房炎组奶牛血清维生素C含量在泌乳各时期均显著降低,与对照组比较差异极显著(P＜0.01),结果如表4所示。

表4 奶牛血清维生素C含量的变化(±S) (μg/m L)

表4 奶牛血清维生素C含量的变化(±S) (μg/m L)

泌乳日数(d) 1 7 14 21 28 35 42对照组 8.49±0.35 8.73±0.55 9.69±0.56 9.68±0.52 9.918±0.2 1 028.00±0.42 10.47±0.5乳房炎组 5.98±0.46** 6.63±0.33** 6.84±0.42** 6.99±0.14** 7.570±0.42** 7.42±0.43** 7.85±0.42**

2.3 奶牛血清硒含量的变化 乳房炎组奶牛血清Se含量在泌乳各时期均显著降低,与对照组比较差异显著(P＜0.05),结果如表5所示。

表5 奶牛血清Se含量的变化(±S) (μg/m L)

表5 奶牛血清Se含量的变化(±S) (μg/m L)

泌乳日数(d) 1 7 14 21 28 35 42对照组 0.110±0.04 0.100±0.05 0.120±0.05 0.120±0.06 0.120±0.04 0.130±0.04 0.120±0.05乳房炎组 0.089±0.004* 0.094±0.007* 0.096±0.004* 0.093±0.008* 0.098±0.009* 0.099±0.006*0.094±0.005*

2.4 奶牛血清锌含量的变化 乳房炎组奶牛血清Zn含量在泌乳各时期均显著降低,与对照组比较差异显著(P＜0.05),结果如表6所示。

表6 奶牛血清锌含量的变化(±S) (μg/m L)

表6 奶牛血清锌含量的变化(±S) (μg/m L)

泌乳日数(d) 1 7 14 21 28 35 42对照组 2.73±0.39 2.98±0.34 3.17±0.29 3.18±0.34 3.27±0.39 3.34±0.31 3.43±0.54乳房炎组 2.17±0.23* 2.35±0.41* 2.39±0.42* 2.51±0.34* 2.42±0.42* 2.67±0.18* 2.61±0.41*

2.5 奶牛血清铜含量的变化 乳房炎组奶牛血清Cu含量在泌乳各时期均显著升高,与对照组比较差异显著(P＜0.05),结果如表7所示。

3 讨论

维生素C是血浆中最有效的抗氧化剂,通过还原作用消除有害氧自由基的毒性,其抗氧化作用表现在可以与O-2·、HOO-·及OH·迅速反应,生成半脱氢抗坏血酸,还能清除单线态氧,还原硫自由基,对高血压患者血管内皮功能起到即时的保护作用[6]。维生素E作为脂溶性抗氧化剂,结合于线粒体膜上,能够就近捕捉或清除自由基,抑制脂质过氧化反应,对线粒体膜、呼吸酶复合体及线粒体RNA等均有很好的保护作用,可有效抑制自由基对线粒体的氧化损伤[7]。

表7 奶牛血清铜含量的变化(±S) (μg/m L)

表7 奶牛血清铜含量的变化(±S) (μg/m L)

泌乳日数(d) 1 7 14 21 28 35 42对照组 1.14±0.08 1.02±0.09 0.98±0.04 0.96±0.06 0.95±0.07 0.94±0.07 0.92±0.06乳房炎组 1.17±0.04* 1.08±0.04* 1.05±0.03* 1.02±0.05* 1.07±0.03* 1.02±0.04* 1.05±0.05*

硒是动物和人必需的微量元素之一,具有增强机体抗氧化能力、免疫力、提高繁殖性能和减少疾病发生等多种重要的生物学功能[8-10]。硒在体内主要是通过硒酶或蛋白发挥其生物学功能的,谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)是一类重要的硒酶,与机体抗氧化有关,能催化过氧化氢和有机氢过氧化物生成水及相应的醇类物质,保护组织和细胞免遭过氧化损伤[8]。在奶牛乳腺免疫机制中,嗜中性粒细胞起着重要作用,硒可以增强嗜中性粒细胞的趋化性,并促进其在血液与乳腺组织内的随机转移[11]。铜是超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的活性中心[12],铜蓝蛋白是细胞外液重要的抗氧化剂。铜缺乏大鼠的红细胞中GSH-Px和G-6-PD酶活性上升,CuZn-SOD活性下降,红细胞中的SOD活力与Cu水平呈正相关。然而,过量的铜会加速人体内分子状氧与有机物的氧化反应,促进游离基的生成,也就促进了脂质过氧化[13]。锌作为超氧化物歧化酶(SOD)的辅酶催化超氧离子发生歧化反应,锌缺乏可以显著降低CuZn-SOD的活性,锌也能终止自由基引起的脂质过氧化链式反应;锌可以激活体内的GSH-Px,锌缺乏使体内有活性的GSHPx数量减少,也由于锌缺乏导致的过氧化脂质生成增多,而使GSH-Px消耗增多导致其活性下降[14]。

本试验结果显示,乳房炎奶牛血清中维生素E、维生素C、Se、Zn的含量均显著低于对照组奶牛,Cu的含量略有升高。维生素E和维生素C通过其抗氧化功能,它们可保护免疫细胞及周围组织免受嗜中性粒细胞杀菌时所产生活性氧代谢物的损害,从而维持免疫细胞及组织的完整性,增强机体抵抗力[15]。已有研究证实,维生素E能够明显增强嗜中性粒细胞的杀菌能力,从而有效预防奶牛乳房炎的发生;Se、Zn、Cu与抗氧化物酶结合增强其清除自由基的能力,降低自由基蓄积对组织细胞的损伤。乳房炎奶牛血清维生素E、维生素 C、Se、Zn含量的降低可能导致了奶牛机体不能有效地捕捉和清除体内过多的自由基,不能有效地阻断自由基脂质过氧化链式反应,从而减弱了机体和乳腺组织细胞的抗氧化能力,加剧了乳房炎奶牛乳腺组织的损伤。

4 结语

本试验研究表明,乳房炎奶牛血清中抗氧化剂维生素E、维生素 C、Se、Zn含量的降低,Cu含量的升高,降低了抗氧化物酶活性,造成自由基蓄积,加剧了自由基对乳腺的氧化损伤。

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