王铁峰,张 宇,钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春 130118)

非结核分枝杆菌(Nontuberculousmycobacterium,NTM)广泛存在于环境中,它能够引发类结核样病变,为结核病的及时防治带来一定的困难[1]。同时,由于其种类多、耐药性多变的特点,也造成了对其鉴别防治的困难。由于国内外没有非结核分枝杆菌鉴别分类的标准操作程序,所以目前对非结核的流行情况调查及分离鉴定数据非常少,使得NTM的科研工作缺少了一定的理论数据,本试验对吉林省内牛NTM的流行情况做了调查,分别采用了生物化学、分子生物学、实验室常规染色等方法进行了细菌的分离鉴定工作,最终得到吉林省境内近年来牛NTM的新的流行情况。

1 材料与方法

1.1 标准菌株和待检样品 试验所用标准菌株偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌均购于中国科学院微生物研究所。鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和副结核分枝杆菌为吉林农业大学微生物教研室保存的国际标准株。

待检样品:试验中从吉林省长春市、德惠市、双阳市、九台市、白城市、四平市、通化市等多个地区采集牛的颌下淋巴结与肠系膜淋巴结作为待检样品。1.2 分离培养基 本试验采用改良罗杰氏培养基(L-J)进行NTM的分离与扩增培养。培养基按照《病原细菌检验技术》中的方法配制。

1.3 各种主要试剂 柠檬酸铁铵、亚碲酸钾、α-荼胺、吐温-80等生化试剂均购自北京化工厂;酚酞二硫酸三钾购自比利时ACROS化学公司;限制性内切酶BstEⅡ、HaeⅢ均购自 Fermeatas公司;引物Tb11和Tb12均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成;Taq酶等分子生物学试剂均购自天根试剂有限公司;其他无机化学试剂均为分析纯试剂,购自北京化学试剂有限公司。

1.4 细菌分离培养 采用酸处理法处理被检样品,用十字匀浆器研磨成浆液状,接种于L-J斜面上,37℃培养,每3 d观察1次,对每一个生长出的菌落做好标记,挑取少量菌体做抗酸染色,并根据菌体形态进行初步鉴定。抗酸染色阴性或8周后仍未生长者为阴性。

1.5 细菌鉴定

1.5.1 生物学与生物化学方法鉴定 生长特性试验:将分离菌接种于 L-J上,分别置于28℃、37℃、45℃条件下培养,定期观察记录生长情况。菌体产色试验:将分离菌设避光与不避光两组进行细菌产色培养试验。培养基生长试验:将分离菌分别接种于PNB培养基、TCH 培养基、5%NaCl培养基、苦味酸培养基、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上,观察其生长情况。生化试验:将分离菌分别采用耐热触酶、硝酸盐还原、吐温-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、铁离子吸收、亚碲酸盐还原等试验检测其生化特性。

1.5.2 分子生物学方法鉴定 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法对分离菌株进行检测。合成通用引物 Tb11:5′-ACCAACGATGGTGTGTCCA T-3′和 Tb12:5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′,对 NTM的保守序列 hsp65进行扩增,反应条件为:94℃5m in预变性,94℃1min变性,60℃1min退火,72℃1min延伸,共30个循环后72℃10m in延伸,均扩增出长度439bp的目的片段。反应完成后将扩增产物用限制性内切酶BstEⅡ和 HaeⅢ进行酶切,2%琼脂糖凝胶电泳检测,根据所得片段确定各分枝杆菌特征性的酶切图谱,从而对分枝杆菌进行鉴别。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果 试验共计检测样品1000份,其中长春市250份(颌下淋巴结与肠系膜淋巴结各125份)、德惠市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)、双阳市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)、九台市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)、白城市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)、四平市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)、通化市125份(颌下淋巴结63份与肠系膜淋巴结62份)。8周内可见菌经抗酸染色为阳性的样品共计25份,NTM阳性培养率为2.5%,成功分离扩增共计14株NTM。

2.2 细菌鉴定结果 经生物学与生物化学方法和分子生物学方法鉴定分类成功分离的菌株中,母牛分枝杆菌1株,龟分枝杆菌脓肿亚种2株,苏加分枝杆菌2株,偶发分枝杆菌1株,蟾蜍分枝杆菌6株,胞内分枝杆菌2株。其中,颌下淋巴结NMT阳性样品为8份,阳性率为1.59%,成功分离出7株,分别是苏加分枝杆菌1株,龟分枝杆菌脓肿亚种2株,蟾蜍分枝杆菌1株,牛分枝杆菌1株,胞内分枝杆菌2株;在肠系膜淋巴结培养物中生长出阳性菌株的样品有17份,阳性率为3.42%,成功分离出7株,其中苏加分枝杆菌1株,偶发分枝杆菌1株,蟾蜍分枝杆菌5株。分离情况见表1、表2。

表1 NTM牛群中检出率

表2 NTM分离扩增的情况 (株)

3 讨论

试验结果,从1 000份牛颌下淋巴结与肠系膜淋巴结中共检出阳性带菌样品25份,牛群中总检出率为2.5%,低于1998年王振国等人3%的调查结果[2],分析:主要有两方面的原因,一个可能是由于饲养管理条件的改善,有试验表明,环境中水源、土壤、饲料、垫料、工作用具等都能够携带并传播NTM[1],这给该菌的防治带来了极大的困难,所以饲养管理条件的加强,对降低该菌的传播与感染具有一定作用;另一个原因可能是试验中所检样品,均采集自经过牛结核(副结核)变态反应检查呈阴性的牛体,减少了结核与非结核分枝杆菌混合感染的对象,也可能成为检出率降低的原因之一。但2.5%的检出率仍然说明NTM单独感染的情况不容乐观,尤其是在目前畜牧业生产过程中并没有专门针对NTM检疫的情况下,NTM的携带与感染给畜牧生产乃至畜牧产品消费者的健康带来隐形的危害。NTM往往不引起典型的症状,所以由其带来的负面影响往往不能够引起畜牧生产者的足够认知,但随着生物的进化,一旦该菌的感染情况明显化,且带来的危害被正确评估,而由于我们的疏于防治,就会滞后对该菌的预防。

试验结果显示,颌下淋巴结的检出率为1.59%,低于肠系膜淋巴结的检出率3.42%,这与钱爱东1988年在猪体内NTM分离情况[3]不同,分析原因:(1)牛的消化方式与猪不同,所以其消化道内微生态环境的不同可能成为其肠系膜淋巴结NTM感染率大于颌下淋巴结的原因之一。(2)饲料情况不同,猪群大都饲喂经过深加工过的饲料,而牛等反刍动物大都饲喂经过简单加工的生草、秸杆等,饲料中的非结核分枝杆菌存活率高,造成牛等反刍动物直接摄取分枝杆菌进入消化道的机率增高。(3)饲养环境差异,猪群无论是集约化养殖还是小规模养殖往往采用圈养的方式较多,活动范围较小,减少了与外界环境中NTM接触的机会,而试验中所调查的牛是主要来自各个地区个体饲养者送屠宰场宰杀的牛只,其散养者居多,活动范围广,与环境中NTM的接触机率高,这可能是造成猪、牛非结核分枝杆菌感染情况的差异之一。从牛颌下淋巴结与肠系膜淋巴结NTM分离率不一,同时与以往猪群中该菌调查情况的差别看来,在对NTM的防治方面,不应仅仅局限于临床诊断、药物防治,还应该从环境微生态学及不同动物生理习惯角度加以研究,这样既能减少医学用药对动物机体的损伤,又能节约成本开支,有利于营造良好的生态环境,不仅仅对NTM的防治,对其他制约动物生产生活条件改善的不利因素都能有积极的作用。

目前,对于NTM能够引起人类疾病的报道越来越多,NTM所能引起的疾病并不局限于呼吸系统[4-5],本试验中所分离到的多种分枝杆菌都有对人致病的报道[6-8],且种类数据与国内外报道的病例基本相符[9-10],带菌牛所产的畜牧产品如肉、奶等经过消费、运输环节可能到达广大消费者手中,使消费者及动物性消费者接触甚至感染该菌,而NTM一旦发病,所采用的治疗药物不同于抗结核药物,需要鉴别诊断后用药才能达到理想的治疗效果,由此引起的危害很大,所以加强对NTM的检验,尤其是致病性NTM的检验是十分必要的,同时也应该注意动物与人之间通过直接或间接接触而导致该菌相互传播的预防。

[1] 杨建华,马丽萍.非结核分枝杆菌感染现状和治疗的探讨[J].医药论坛杂志,2004,25(17):3-4.

[2] 王振国,罗雁飞,床广文.牛源非典型分枝杆菌的分离与鉴定[J].吉林农业大学学报,1998,20(2):73-77.

[3] 钱爱东,陈奖励.猪源MA IC菌分离及其血清型的研究[J].吉林农业大学学报,1988,10(3):79-84.

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