金 实,金 华,陈 瑛,李 灿,金海峰,崔镇花

（延边大学附属医院肾内科,吉林延吉 133000）

糖尿病肾病（DN）是常见的糖尿病微血管并发症之一,其主要的病理改变是毛细血管基底膜增厚及系膜基质增生,最终导致肾小球硬化。目前DN的确切发病机制尚未完全阐明。近年的研究发现炎症因子及促炎症因子与DN的发生发展密切相关,并认为DN是一种炎症性疾病[1]。MCP-1是单核/巨噬细胞特异性的趋化因子,在糖尿病肾病的发生、发展中起着很重要的作用,可趋化单核/巨噬细胞在肾组织的浸润,与细胞外基质（ECM）的沉积、肾小球硬化密切相关[2]。ACEI主要通过阻断血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的生成,阻断肾素-血管紧张素系统（RAS）、抑制一系列炎症因子的分泌,抑制或减轻DN炎性病理损害,故在DN的治疗中已被临床广泛使用;来氟米特是一种新型的免疫抑制剂,可减少IgG免疫复合物在肾小球内的沉积以及DN大鼠肾组织中MCP-1的表达,起到保护肾脏的作用。两者联合应用可能更好地保护肾脏功能,延缓DN进展,为探讨此可能性。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

来氟米特（商品名为爱诺华）由苏州长征-欣凯制药有限公司提供,贝那普利（商品名为洛汀新）由北京诺华制药有限公司提供。链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）,兔抗大鼠 MCP-1抗体、SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）。血糖仪（美国强生稳豪血糖仪及其配套试纸）,日立7600全自动生化分析仪。

1.2 动物与分组

取体重在180 g-200 g的Wistar雄性大鼠（由延边大学医学部动物科提供）40只,按昼夜时程平衡饲料喂养,自由饮水、进食,经1周喂养适应期后,测定血糖,均正常。禁食12小时后,随机取10只大鼠作为正常对照组（NC,n=10）;其余30只大鼠,一次性腹腔注射STZ[4]（65 mg/kg,溶于pH4.5,0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液,冰浴新鲜配制）,NC组注射等量的枸橼酸钠缓冲液。48 h后取大鼠尾尖血,测血糖值均≥16.7 mmol/L,DN模型成功。正常对照组血糖正常。将模型组30只大鼠随机分成三组,即对照组（DN组,n=10）、贝那普利组（n=10）和贝那普利+来氟米特组（联合用药组,n=10）。造模成功第二天起,贝那普利组每天给予贝那普利（10mg/kg/d）灌胃,联合用药组每天给予来氟米特（10mg/kg/d）和贝那普利（10mg/kg/d）灌胃,NC组与DN组每天给予等量蒸馏水灌胃。

1.3 标本收集

在实验第4周末、8周末、12周末,测体重;将大鼠置于清洁的代谢笼中,收集24小时尿,测量24小时尿蛋白排泄量（24 hUPE）、尿肌酐（Ucr）;乙醚吸入麻醉后,采用断尾法采约2ml血,测血糖（Glu）、血肌酐（Scr）,计算内生肌酐清除率（Ccr）。由于Ccr受体表面积的影响,采用Ccr/体重（kg）加以校正。

Ccr（m l·min-1·kg-1）=尿肌酐（μmol/l）×每分钟尿量（m l/min）/[血肌酐（μmol/l）·体重（kg）]

1.4 病理学检查

（1）在实验第12周末,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖开腹腔,取出肾脏,取2mm厚的肾组织,用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,行PAS染色（过碘酸雪夫氏染色）和MCP-1免疫组化染色的光镜样品制备。（2）免疫组织化学染色（MCP-1）:切片厚 4μm,以酒精梯度常规脱蜡至水;含3%H2O2的甲醇室温孵育10min,阻断内源性过氧化物酶;高压修复抗原;加入1∶100稀释的兔抗鼠单克隆抗体,置湿盒中4℃过夜;1∶100稀释生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育25min;DAB显色:1m l蒸馏水加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制反应时间5-10m in;苏木素轻度复染细胞核,脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察肾组织细胞浆内有棕褐色颗粒者为阳性。每批均设有阴性对照。采用双盲法在光镜下随机选择20个肾小球/片,计数肾小球的阳性细胞数及细胞总数,MCP-1在肾小球细胞中的标记值为阳性细胞数/细胞总数。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS11.5软件进行统计学处理,数据均以均数±标准差（±s）表示,两组间比较采用LSD-t检验,两组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时期血糖的变化

DN组、贝那普利组及联合用药组大鼠血糖较NC组明显升高（P＜0.01）,且维持在较高水平上。DN组和贝那普利组及联合用药组大鼠之间血糖值相近,无显著性差异（P＞0.05）（见表1）。

2.2 不同时期各组大鼠24小时尿蛋白排泄量的变化

DN组、贝那普利组及联合用药组大鼠24hUPE较NC组显著升高（P＜0.01）,同期贝那普利组和联合用药组较DN组显著降低（P＜0.01）,联合用药组较贝那普利组明显降低,均有统计学意义（P＜0.05）。（见表2）

2.3 不同时期各组大鼠内生肌酐清除率的变化

表1 不同时期各组实验大鼠血糖（mmol/l）比较（±s）分组 4w 8w 12w NC组 6.50±0.31 6.46±0.20 6.50±0.57 DN组 25.70±0.83* 24.73±0.92* 25.49±1.67*贝那普利组 24.81±1.06* 23.21±0.93* 24.20±1.15*联合用药组 24.48±1.07* 24.22±0.85* 24.68±1.16*注:*与对照组相比,P＜0.01

表2 不同时期各组实验大鼠24hUPE（mg）比较（±s）分组 4w 8w 12w NC组 8.41±0.19 8.59±0.18 8.47±0.18 DN组 21.89±1.251） 28.18±2.041） 35.07±1.721）贝那普利组 17.31±1.411）3）19.29±0.801）2）22.06±0.651）2）联合用药组 13.24±1.501）2）4）14.11±1.261）2）5）17.50±0.951）2）5）注:1）与对照组比较,P＜0.01;2）与模型组比较,P＜0.01;3）与模型组比较,P＜0.05;4）与贝那普利组比较,P＜0.05;5）与贝那普利组比较,P＜0.01

DN组、贝那普利组及联合用药组大鼠Ccr较NC组显著升高（P＜0.01）,贝那普利组及联合用药组较DN组显著降低（P＜0.01）,联合用药组较贝那普利组更低,均有统计学意义（P＜0.05）。（见表3）

表3 不同时期各组大鼠 Ccr（m l·m in-1·kg-1）比较（ ±s）分组 4 w 8w 12 w NC组 3.52±0.45 3.38±0.30 3.39±0.21 DN 组 6.17±0.361） 5.85±0.141） 5.38±0.241）贝那普利组 5.13±0.231）2） 4.71±0.361）2） 4.20±0.131）2）联合用药组 4.74±0.321）2）3）4.42±0.921）2）3）4.01±0.171）2）3）注:1）与对照组比较,P＜0.01;2）与模型组比较,P＜0.01;3）与贝那普利组比较,P＜0.05

2.4 肾组织病理分析

（1）PAS染色:DN组表现为肾小球体积明显增大、系膜基质增生、基底膜增厚等典型的DN病理表现。联合用药组与贝那普利组肾组织病理改变较DN组轻,肾小球体积有所缩小,系膜基质增生较DN组轻。联合用药组与贝那普利组相比,上述改变更轻。（见图1）（2）免疫组化染色:MCP-1在肾小球内的表达:NC组在光镜下肾小管着色,肾小球不着色或微量着色;DN组、贝那普利组及联合用药组,肾小球MCP-1表达显著增加（P＜0.01）。（3）MCP-1表达半定量分析:与DN组比较,贝那普利组与联合用药组MCP-1阳性细胞数显著下降（P＜0.01）;而联合用药组与贝那普利组比较,MCP-1阳性细胞数也明显下降（P＜0.05）。（见图2、表4）

表4 各组实验大鼠肾脏MCP-1阳性细胞标记值比较（±s）NC组 DN组 贝那普利组 联合用药组MCP-1 0.02±0.01 0.46±0.051） 0.35±0.031）2） 0.23±0.031）2）3）注:1）与对照组比较,P＜0.01;2）与模型组比较,P＜0.01;3）与贝那普利组比较,P＜0.05

图1 各组大鼠肾组织PAS染色（×400）

图2 各组大鼠肾组织免疫组化（MCP-1）（×400）

3 讨论

最近Katherine[3]提出把糖尿病肾病看作是一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病,在动物模型和人DN肾活检标本中均发现有巨噬细胞在肾小球和肾小管间质中浸润。DN组织中,多种炎症介质、细胞因子、粘附分子以及趋化因子如TNF-a、MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、骨桥蛋白（OPN）、巨噬细胞集落刺激因子等表达增多,NF-KB活性增加。糖尿病患者体内存在增强的炎症反应并参与了糖尿病肾病的发生[4]。可见,炎症反应和炎症过程参与了DN的发生与发展,其重要作用不容小视。因此认为,用某种途径抑制这些炎症因子的表达,能够延缓DN的发生和发展,从而为DN的抗炎治疗提供了理论依据。

MCP-1是特异性的单核/巨噬细胞趋化因子,能促进单核细胞的移动和活化,在慢性炎症的发病过程中起关键作用。研究发现MCP-1在糖尿病肾病的发生、发展中起着很重要的作用,可趋化单核/巨噬细胞在肾组织的浸润,与细胞外基质（ECM）的堆积、基底膜增厚、肾小球硬化密切相关[2]。MCP-1由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肾小球系膜细胞等表达,其在生理情况下呈低水平表达,糖尿病时在高血糖、蛋白非酶糖基化产物、血管紧张素Ⅱ、氧化应激、炎症和肾小球血流动力学改变等刺激因素影响下表达明显上调[5]。在DN,由于高血糖刺激系膜细胞使MCP-1表达增多,MCP-1作为一种炎性细胞的趋化因子,诱导血循环中单核/巨噬细胞向肾内聚集、活化,活化的巨噬细胞能分泌TNFa、IL-6、转化生长因子-β（TGF-β）及氧自由基（ROS）等炎性细胞因子和炎性介质,这些细胞因子通过自分泌和旁分泌的级联作用,使这些细胞因子持续增高,趋化更多的炎症细胞（如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等）向肾内浸润,使肾内炎症持续。同时,细胞因子（如TNFa、IL-6、TGF-β等）刺激系膜细胞增殖,合成大量的Ⅳ型胶原、层黏蛋白（FN）等细胞外基质（ECM）成份,同时抑制ECM降解,导致ECM聚集,肾小球硬化,增高的细胞因子同样能促使肾小管上皮细胞增殖,引起肾间质纤维化。本研究也证实DN时肾组织内MCP-1的表达明显增加,而联合应用贝那普利和来氟米特,明显抑制了DN大鼠肾组织中MCP-1的表达,使肾组织病理改变及肾功能损害得到缓解,从而起到保护肾脏的作用,延缓DN进展。

ACEI主要通过阻断AngⅡ的生成,阻断肾素-血管紧张素系统（RAS）、抑制一系列炎症因子的分泌,减轻或抑制DN炎性病理损害,故在DN的治疗中已被临床广泛使用。已有实验证实使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）能明显抑制糖尿病肾小球MCP-l基因的表达,并伴随蛋白尿的减少和肾小球中浸润巨噬细胞数量的减少[6]。也有研究报道,贝那普利能减少MCP-1在DN大鼠肾组织中的表达[7],本文研究结果与此结论一致。

有实验表明来氟米特能减少IgG免疫复合物在肾小球内的沉积,明显减轻肾小球肾炎的病理表现[8]。本研究显示联合用药组效果优于单用贝那普利组,说明两者联合应用可以更好地保护肾脏功能,延缓DN进展,为来氟米特在DN治疗上的应用提供了理论依据。本研究中显示联合治疗组和贝那普利组,均能使24hUPE、Ccr减少,而联合治疗组较贝那普利组更显著。12周末肾组织病理显示DN组肾小球体积增大,肾小球系膜增生,基底膜增厚;而联合治疗组和贝那普利组上述病理改变显著减轻、MCP-1表达显著下降,而且联合治疗组优于贝那普利组。说明应用免疫抑制剂来氟米特联合ACEI贝那普利不仅抑制血管紧张素Ⅱ的生成,而且降低了肾组织内MCP-1的表达,从而减少单核/巨噬细胞在肾小球的广泛浸润,减少其导致的细胞外基质堆积及基底膜增厚,进而延缓肾小球硬化,最终达到延缓DN的发生发展。虽然本研究提示贝那普利联合应用来氟米特可延缓DN发展,但贝那普利和来氟米特分别通过哪些作用机制来抑制MCP-1的表达有待于进一步研究。

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