刘 红,朱朝辉

(广东省农业科学院畜牧研究所畜禽育种国家重点实验室,广东 广州 510640)

禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的一种传染性肿瘤病。ALV在鸡群中的存在分为A、B、C、D、J、E等多种亚型。近10年所报道的分离的ALV毒株大部分为J亚群,少部分为A、B亚群。目前国内外已经建立了很多ALV的检测方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交(ISH)、荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)等。本文就目前国内外禽白血病的检测中较常用的一些方法做一简述。

1 抗原检测方法

1.1 ELISA方法 ELISA方法的特点是特异性、敏感性高,设备要求低,适合大批量的流行病学调查和生产净化。Ignyatovic等在1982年报道用抗原捕获ELISA的方法进行GSA p27抗原检测。韩静等用抗A LV-p27的多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA 方法用于检测 A、B、J亚群A LV[1]。

目前市场上已有用于检测ALVp27抗原ELISA试剂盒出售。不同试剂盒之间敏感性存在差异,郭慧君等对3种ELISA抗原检测试剂盒进行灵敏度比较,发现3者之间灵敏度差异显著[2]。

在样品选择方面,有研究表明蛋清中内源性ALV的ELISA反应假阳性结果少,因此蛋清样品被认为是ALV抗原ELISA检测的理想材料。

1.2 IFA方法 IFA方法可对抗原进行细胞定位。但是该检测方法有时会产生非特异性荧光,且仅限于实验室检测。1983年Spencer等就建立了针对GSA抗原的IF技术,用于自然感染ALV的产蛋母鸡的病毒传播和感染分布检测[3]。

1.3 PCR方法

1.3.1 直接PCR 用PCR方法检测A LV核酸,是判断病毒能否复制的一种指标。中国农业大学徐镔蕊等从病死鸡的肿瘤和组织中提取DNA,用设计的 ALV-J 引 物 H5/H7(H5:5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′,H7:5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′)进行 PCR扩增和序列测定,从分子水平上证实了蛋鸡J亚群禽白血病的发生[4]。尹逊河等直接从山东省3个不同AA肉鸡场的鸡胚和1日龄雏鸡的各组织器官提取DNA,根据乔彩霞等已经发表的针对 p27的引物序列上游 5′-CCCGTGGAAT TCATGTAG TGAT TAAG-3′和下游 5′-CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3′进行了PCR扩增及产物序列测定,结果表明,ALV阳性检出率从高到低顺序为弱雏＞死胚＞健康雏＞正常胚。在各脏器中以肾脏中的病毒含量最多[5]。

在样本检测方面,Irit Davidson等研究表明作为PCR检测的 DNA提取样本,鸡的羽毛尖优于肝、脾等脏器[6]。

1.3.2 RT-PCR 与PCR方法相比,RT-PCR方法检测时间长,检测成本高。但是它能够更准确检测病毒的存在。而且有学者认为采用从感染细胞提取总RNA进行RT-PCR,比直接从前病毒DNA进行PCR更容易得到完整的GAG和 p27基因。Pham等研究表明,RT-PCR在检测蛋清A LV方面比ELISA更加敏感,更易与进行 ALV亚型的区分[7]。Coffinet等报道了用于鉴定 ALV A、B、C、D、E各个亚型的RT-PCR引物序列,扩增片段长度在300bp以下[8-10]。

1.3.3 QRT-PCR QRT-PCR是近年来发展起来的一种新的检测技术。与传统PCR相比,具有快速、自动化程度高、灵敏度高的特点。Yongbaek Kim等建立了基于ALV-J的特异性引物H5/H7的QRT-PCR技术用于ALV-J的定量,研究结果表明,这种QCRT-PCR方法可以定量到25fg的病毒RNA[11]。2008年李佳桃等建立了基于ALV群特异性基因gag基因的QRT-PCR的方法,最低可检测82个拷贝的病毒核酸,与普通PCR方法相比,灵敏度高出1000倍[12]。而林甦等针对A LV-J ENV基因gp85区的片段,建立的QRT-PCR方法,检测下限为8650个拷贝[13]。

1.3.4 其他PCR技术 巢式PCR敏感性高,但也因此最容易受污染。Hitoshi Hatai等建立了从干燥的羽毛干中提取RNA或DNA进行ALV鉴定的巢氏PCR技术[14]。多重PCR可以在一次试验中检测出不同的病原。周刚等建立了同时鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法可鉴定所有亚群的A LV[15]。

1.4 ISH IS H可以利用特定核酸顺序进行病毒RNA的精确定量定位。Arshad S S等利用建立的针对J亚型ALV GAG或EN V序列的ISH技术发现腔上囊是病毒复制和基因表达的首选器官[16]。Stedman N L等利用IS H技术对自然感染的鸡群进行ALV-J的定位,发现心肌细胞、蒲金野氏纤维、脑垂体染色最深,病毒含量最高[17]。

1.5 病毒分离 目前的方法有鸡胚分离培养和细胞培养。该方法适用于ALV的流行病学调查和净化。但该方法的检测周期长,技术要求高,在临床实践中的应用和推广存在一定难度。

2 抗体检测方法

目前市场上已有ALV-AB、J亚型抗体的检测试剂盒出售。扬州大学叶建强等利用ALV-J特异性单抗JE29,建立了通过检测A LV-抗原-抗体免疫复合物来诊断ALV-J的ELISA方法。该 ELISA具有良好的ALV-J ENV抗原特异性[18]。

在检测样本方面,传统的抗体检测普遍采用血清作为检测样本。但是Garrido M F等发现接种ALV A亚群标准株 RAV-1的白来航鸡中羽髓(1羽髓加800μL缓冲液稀释)中抗体水平和1∶500血清中抗体水平相关性显著[19],因此认为羽髓也是进行ALV抗体检测的可选样本。

ALV在鸡体内的作用机理很复杂,鸡体的排毒情况也在不断变化之中,同时由于鸡群个体差异的存在和检测方法的局限性,使用单一一种方法进行白血病检测,存在一定的疏漏。故在检测时,如有可能,应根据检测目的、鸡群代次、检测时期和样本,采取2～3种方法同时进行检测。

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