叶成玉，王戈平，陆 艳，蔡其刚，牛小迎，李晓卉，马利青

（青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016）

马巴贝斯原虫病是马属动物包括（马、驴、骡和斑马）的一种蜱媒病，这种疾病是由马属小巴贝斯原虫[babesia（theileria）equi]和马巴贝斯原虫（babesia caballi）血源性寄生原虫引起的。其死亡率取决于受侵害动物的总体免疫状况及病原生物的毒力。高死亡率常发生在从无巴贝斯原虫的区域引进到巴贝斯原虫流行地区的最初感染的马匹中。

在流行地区，严重的巴贝斯原虫病的临床病例病情相对罕见，马属动物巴贝斯原虫病在欧洲、非洲、阿拉伯、亚洲（日本除外）的许多地区流行。由于潜在的蜱媒介几乎全球分布，必须防止携带者引入到非流行地区或国家[1]。在进口到非流行地区或国家之前，通过对马属动物巴贝斯原虫病血清学试验必须证明是阴性的[1-3]。目前，补体结合试验（CFT）的和间接荧光抗体试验（IFAT）通常用于检测B.equi和B.caballi寄生虫抗体的存在。

然而，这些血清学试验受到抗原供应有限和特异性差的限制[1-2]。最近，我们开发了采用重组抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA试剂盒），并表明该ELISA试剂盒可以分别替代CFT和IFAT作为B.equi和B.caballi感染的诊断方法[4-9，11-13]。在本研究中，我们用重组抗原的ELISA诊断试剂盒对中国新疆西部驴的马属动物巴贝斯原虫病的流行进行了调查。

青海省位于中国西北部，是中国最大的内陆省。气候是具有温暖的夏天和寒冷的冬天主要是气候干燥的大陆，平均气温夏季（7月）为25.7℃（喀什）或22.7℃（伊犁）及冬季（1月）-6.0℃（喀什）或-9.5℃（伊犁）。马属动物是这青海地区重要的动物，并被当地人民广泛用于交通运输，至今青海的马属动物还没有关于马巴贝斯原虫病流行的报道，而临近的新疆地区的马属动物有马巴贝斯原虫病流行的报道[15]。

1 材料和方法

1.1 重组抗原

1.1.1 一种用以大肠杆菌表达重组截短的巴贝斯虫裂殖子抗原2（EMA2t）并通过pGEX传播媒介的ELISA法，对于驴上B.equi感染的诊断，如前所述进行[7]。

1.1.2 一种采用以大肠杆菌表达重组的Bc48蛋白并以pGEX为传播媒介的ELISA方法，用于对驴上B.caballi感染的诊断，采用别处描述的方法进行[8-9]。

1.1.3 阴、阳性标准血清，均为日本国家原虫中心玄学南博士惠赠，青海省畜牧兽医科学院兽医所生物技术研究室保存。

1.2 被检血清的采集和处理

1.2.1 317份马属动物血清血清样品均采自青海省，其中：马血清192份（分别采自乌兰县76份；德令哈市18份；湟源县98份）；骡血清46份（互助县19份；民和县27份）；驴血清79份（湟中县）。

1.2.2 采血时均空腹、桡静脉采集，采集后摆成斜面，置 4℃冰箱5 h后，放在室温待血清析出后收集血清，-20℃冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材

均购自国内和 Sigma公司供应商。

1.4 ELISA方法

1.4.1 抗原的包被 重组的B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST作为抗原，按10μg/mL剂量加到包被液中（50mm carbonate-bicarbonate buffer，pH9.6），混匀后加到 96 孔平底微量板（Nunc，Denmark）的孔里，每孔50μL，并且在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS冲洗液冲洗一次后，残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔100μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗一次，在封阻液中按1:100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1:4000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了山羊抗马、骡和驴的 IgG 抗体（Bethyl Laboratories，USA），稀释后每孔加50μL，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100μL底物，每mL底物中含有0.3 mg的 1，2’-azino-bis（3-ethylbenz-thia zoline-6-sulfonic acid），0.1M 柠檬酸，0.2M的磷酸缓冲液和0.003%H2O2，每孔加100μ L。

1.4.6 读数 用Wellscan MK 3酶标读数仪（Labsystems Dragon，Finland）在光吸收值OD415nm条件下测定光吸收值。

1.4.7 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.2，在B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST孔之间的光密度吸收值是不同的，两个孔之间的差值为该被检样品的光密度吸收值（OD值）。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于0.3；两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.2；两孔待检样品的平均值等于或大于0.2为阳性，低于0.2为阴性。

2 结果

经过对所收集的317份马属动物血清抗体的检测，共检出B.equi血清16份，阳性率为5.05%；B.caballi血清11份，阳性率为3.47%；其中乌兰县的76份马血清中检出B.equi血清3份，阳性率为3.95%；B.caballi血清2份，阳性率为2.63%；德令哈市的18份马血清中检出B.equi血清2份，阳性率为11.11%；B.caballi血清1份，阳性率为5.56%；湟源县的18份马血清中检出B.equi血清2份，阳性率为2.04%；B.caballi血清2份，阳性率为2.04%；互助县的19份骡血清中检出B.equi血清2份，阳性率为10.05%；B.caballi血清0份，阳性率为0%；民和县的27份骡血清中检出B.equi血清3份，阳性率为11.11%；B.caballi血清2份，阳性率为7.41%；湟中县的79份驴血清中检出B.equi血清4份，阳性率为5.06%；B.caballi血清2份，阳性率为5.06%。同时有4分血清既是B.equi阳性和又是B.caballi阳性，其中2份来自乌兰县的马血清，2份来自湟中县的驴血清。结果初步说明我省马属动物群中存在B.equi和B.caballi的感染，详见表1。

3 讨论

中国以前仅有少量的关于马equinebabesiosis流行的报道[12-14]。近年来，关于马equine babesiosis的报道增多。因此，引起了分别在中国西北部和东北部的新疆和吉林省的高度关注。据我们的了解，这是在中国驴匹上关于马属动物巴贝斯虫病调查描述的首次报道。在与中国新疆边境接壤的蒙古有几篇关于马属动物巴贝斯虫病流行的报道已发表[11，15-16]。这些研究表明在蒙古和Battsetseg等地的马B.equi和B.caballi感染广泛传播[17]。据报道在蒙古Dermacentor nuttalli能够传播这两种巴贝斯虫。在流行地区控制可能的蜱媒被认为减少感染和增加马和驴的数量和质量的一种有效方法。现今对于新疆地区马属动物巴贝斯焦虫病的蜱媒介仍是未知的，因此，迫切需要鉴定新疆地区涉及B.equi和 B.caballi传播的潜在媒介。

总之，在马上B.equi比B.caballi感染更为普遍，然而，在本研究中，在新疆西部驴B.equi（9.6%）感染的阳性率低于B.caballi（38.7%）。此时该原因仍然未知，需要做大规模流行病学研究来阐述这个问题。

在本研究中，所有被检测的317份马属动物血清均采自本地区，表明equine babesiosis在该地区马属动物血清上呈地方流行性，需要设计更正式的流行病学研究以确定感染的群体动力学和可能的传播媒介的角色。另外，所有血清学阳性的马属动物血清均未表现出明显的临床症状，自从这些马属动物血清不断的接触B.equi和 B.caballi感染，它们可能获得了相对较高的免疫性。

[1]Skotarczak B.Babesiosis of human and do mestic dog：ethiology，pathogenesis，diagnostics[J].Wiad Parazytol，2007，53（4）：271-280.

[2]Bruning A.Equine piroplasmosis an update on diagnosis，treatment and prevention.Br Vet J[J].1996，152（2）：139-151.

[3]Tenter AM，Friedhoff KT.Serodiagnosis of experimental and natural Babesia equi and B.caballi infections[J].Vet Parasitol，1986，20（1/3）：49-61.

[4]HirataH，IkadaiH，YokoyamaN，etal.Cloning ofa truncated Babesia equi gene encoding an 82-kilodalton protein and its potential use in an enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Clin Microbiol，2002，40（4）：1470-1474.

[5]Hirata H，Xuan X，Yokoyama N，et al.Identification of a specific antigenic region of the P82 protein of Babesia equi and its potential use in serodiagnosis[J].J Clin Microbiol，2003，41（2）：547-551.

[6]Hirata H，Yokoyama N，Xuan X，et al.Cloning of a novel Babesia equi gene encoding a 158-kilodalton protein useful for serological diagnosis[J].Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（2）：334-338.

[7]Huang X，Xuan X，Yokoyama N，et al.High-level expression and purification of a truncated merozoite antigen-2 of Babesia equi in Escherichia coli and its potential for immunodiagnosis[J].J Clin Microbiol，2003，41（3）：1147-1151.

[8]Ikadai H，Osorio C R，Xuan X，et al.Detection of Babesiacaballi infection by enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant 48-kDa merozoite rhoptry protein[J].Int J Parasitol，2000，30（5）：633-635.

[9]Ikadai H，Xuan X，Igarashi I，et al.Cloning and expression of a 48-kilodalton Babesia caballi merozoite rhoptry protein and potential use of the recombinant antigen in an enzyme-linked immunosorbentassay[J].J Clin Microbiol，1999，37 （11）：3475-3480.

[10]Tamaki Y，Hirata H，Takabatake N，et al.Molecular cloning of a Babesia caballi gene encoding the 134-kilodalton protein and evaluation of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（1）：211-215.

[11]Xuan X，Larsen A，Ikadai H，et al.Expression of Babesia equimerozoite antigen 1 in insectcellsby recombinant baculovirus and evaluation of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbentassay[J].J Clin Microbiol，2001，39（2）：705-709.

[12]Xuan X，Chahan B，Huang X，et al.Diagnosis of equine piroplasmosis in Xinjiang province of China by the enzyme-linked immunosorbentassays using recombinantantigens[J].Vet Parasitol，2002，108（2）：179-182.

[13]Xu Y，Zhang S，Huang X，et al.Seroepidemiologic studies on Babesia equi and Babesia caballi infections in horses in Jilin province of China[J].J Vet Med Sci，2003，65（9）：1015-1017.

[14]Yin H，Lu W，Luo J.Babesiosis in China[J].Trop Anim Health Prod，1997，29（S4）：11S-15S.

[15]Avarzed A，De Waal DT，Igarashi I，et al.Prevalence of equine piroplasmosis in Central Mongolia[J].Onderstepoort J Vet Res，1997，64（2）：141-145.

[16]Boldbaatar D，Xuan X，Battsetseg B，et al.Epidemiological study of equine piroplasmosis in Mongolia[J].Vet Parasitol，2005，127（1）：29-32.

[17]Battsetseg B，Xuan X，Ikadai H，et al.Detection of Babesia caballi and Babesia equi in Dermacentor nuttalli adult ticks[J].Int J Parasitol，2001，31（4）：384-386.