云南万绿生物股份有限公司 罗秉俊 张苏云

目的：通过凝胶层析法提高芦荟多糖的含量

基本原理：凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。由此过程，较大的芦荟多糖分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离提纯。

器材及试剂

玻璃层析柱；葡聚糖凝胶；芦荟凝胶汁

实验内容

干胶用量的计算

干胶用量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的床体积（ml/g）

由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10%～20%。

凝胶的处理：葡聚糖凝胶市售商品为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。

凝胶柱的装备：凝胶柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。

首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1∶10～50；同时将柱子洗涤干净。然后关闭层析柱出口，装入1/3柱高的洗脱液，将处理好的凝胶缓慢地倒入柱中，打开出水口，控制适当流速，使凝胶均匀沉降，再加入一定量的洗脱液（控制凝胶不分层，否则必须重新装柱）。最后用滴管吸去凝胶床面上的溶液，使洗脱液恰好流到床表面，同时关闭出水口。

加样与洗脱：加样要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%～5%左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10%～25%。

加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数毫升洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。

洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数毫升。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。

凝胶柱的重复使用与保存：当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。

打开出水口，继续用2～3倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。

保存方法有三种：（1）在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此方法至少可以保存半年以上。（2）用完后，以水冲洗，然后用60%～70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。（3）长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃～80℃干燥后保存。

小结：通过凝胶层析法提纯芦荟多糖，有效地去除了芦荟凝胶汁里的小分子杂质，使芦荟凝胶汁的多糖含量从原来的5%提高到18%，成为分离纯化芦荟大分子的一种重要手段。