李洪伟，郭开今，周 冰，辛 兵，陈向阳，葛保健

(徐州医学院附属医院，江苏徐州221002)

人骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中存在的一类非造血组织干细胞，具有高度增殖和自我更新能力，并具有多向分化潜能，它不仅能分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等［1］，还可跨胚层分化为肝细胞［2］、神经细胞［3］、心肌细胞［4］，已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。由于骨髓中细胞成分比较混杂，MSC在骨髓中的含量极少，仅占骨髓中有核细胞的0.001%～0.01%，实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增。2009年3月～2010年2月，为寻找适宜MSC体外分离、培养和扩增方法，并分析其生物学特性，我们进行了相关实验。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 Percoll分离液(Pharmacia公司)，藻红蛋白(PE)标记鼠抗人CD90、CD105单克隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记鼠抗人CD34、CD11b单克隆抗体，RNase、碘化丙啶(PI)，牛血清白蛋。倒置相差显微镜，流式细胞仪。

1.2 MSC分离及培养方法

1.2.1 MSC的分离 无菌条件下从健康成人志愿者的髂骨处抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，轻轻摇匀，用DMEM培养基稀释1倍容积后，缓慢加入等量的Percoll分离液，2 500 r/min离心30 min，收集白膜层的单个核细胞，以PBS洗涤离心2次，按2×105/cm2密度接种于底面积为25 cm2的培养瓶中，加入完全培养基5 ml，置于5%CO2、37℃培养箱内孵育。

1.2.2 MSC的原代培养 接种后48 h进行首次半换液，弃未贴壁细胞，补充培养基;间隔2 d再次半换液，去除未贴壁细胞。以后细胞隔日洗涤、全量换液，使细胞逐渐纯化。

1.2.3 MSC的传代培养 原代培养细胞生长至80%～90%融合时，弃原培养液，PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶溶液消化3～5 min，倒置显微镜下观察大部分细胞逐渐趋于圆形，但尚未脱落时将溶液弃去，胎牛血清终止消化。用吸管将贴壁的细胞轻柔吹打成悬液，离心收集细胞，获原代MSC，按1∶3的比例传代，并标记为P1，在37℃、5%CO2和饱和湿度条件下继续培养，2～3 d换液1次。待细胞达80%以上融合后，重复以上操作，进行传代，标记为P2，余类推。

1.3 细胞生长曲线绘制及细胞生物学活性检测

1.3.1 细胞生长曲线绘制 取生长状态良好的P1、P3、P5细胞，消化成单细胞悬液后，以1×104孔接种于24孔板继续培养。每天同一时间取3孔细胞消化计数，每孔计数3次，计算平均值，连续测定7 d。绘制细胞生长曲线。

1.3.2 细胞表面抗原检测 取第3代生长融合达80%的贴壁细胞，PBS洗涤后，以0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数后取2×106个细胞并分装6管，以含2%牛血清白蛋白的PBS洗涤。每管分别加入20 μl的CD34-FITC、CD11b-FITC、CD90-PE及CD105-PE单克隆抗体，另设3管分别用同型对照单克隆抗体确定背景标记，室温避光放置30 min。以PBS洗去未标记抗体，离心后细胞加入含1%多聚甲醛的PBS固定。用流式细胞术检测，用配套的Cell Quest软件计算细胞表面抗原阳性率。

1.3.3 细胞周期测定 取第3代生长状态良好的MSC，消化离心后收集，计数达1×106/ml，去除细胞碎片。加入1 ml预冷的70%乙醇，吹打均匀，封口，4℃固定24 h。检测前离心去除固定液，加入10 mg/ml的RNase 20 μl，37℃水浴30 min，PBS洗涤l次，离心去上清，加入50 μg/ml的PI 1 ml，4℃避光染色30 min，300目滤网过滤后用流式细胞术检测，进行细胞周期分析。

2 结果

2.1 细胞形态学 刚接种的MSC大多呈圆形，单核;培养24 h后，部分细胞贴壁伸展，并开始聚集成细胞集落;48 h时贴壁细胞显著增多，以椭圆形为主，部分细胞呈短梭形;4 d后成纤维细胞样集落形成(CFU-F)，由10～30个细胞组成，细胞形态为长梭形或多角形;11 d后细胞集落间相互融合成单层，长满整个培养瓶，细胞排列呈平行状或漩涡状。传代培养的细胞生长速度较原代培养明显增快，不再形成细胞集落，7～8 d即可铺满瓶底。

2.2 细胞生长曲线 P1、P3、P5细胞生长曲线均呈S形(见图1)，具有以下共同特征:细胞潜伏期为1～2 d，从第3天细胞大量增殖进入对数生长期，第6天达到高峰期，以后进入平台期。P5细胞第3天起其生长速度低于P1、P3细胞，但P＞0.05。

图1 P1、P3、P5 MSC生长曲线

2.4 细胞周期 P3 MSC中，处于G0/G1期细胞约占77.42%，处于S+G2/M期细胞约占22.58%。大部分细胞处于相对不活跃的静止期，只有小部分处于活跃的增殖状态，符合干细胞的特性。

3 讨论

MSC因其广阔的应用前景而成为目前关注热点［5］。高纯度MSC的获取是间充质干细胞研究的理想基础条件。目前从骨髓中分离培养MSC的方法主要有贴壁筛选法［6］、密度梯度离心法［1］和免疫法［7］。传统的贴壁筛选法操作简单，价格低廉，但所得细胞纯度不高。密度梯度离心法操作较复杂，且分离时会丢失一定数量的MSC而不能有效达到较高的分离率，但所得细胞纯度比贴壁法高。免疫法主要有流式细胞仪分离和免疫磁珠分选技术，分离获得的MSC纯度最高，但实验条件要求高，需要骨髓量大。本实验用Percoll分离液对全骨髓做梯度离心，去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞，再根据其贴壁性差异，换液弃除悬浮生长的造血细胞，获得纯度较高、增殖能力较强、生长性状稳定的MSC。

MSC虽然是一群均质细胞，但兼具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点，缺乏特异性的识别标志［8］，且同发育阶段的MSC表面标志也可能存在差异。一般认为［1，9］整合素家族成员的CD29、黏附分子CD44、CD166及CD90、CD105等是MSC保持未分化状态时重要的表面标志，不表达造血细胞的标志性抗原是CD11、CD14、CD34及CD45。由于MSC无特异性的表面标志物，因此其准确鉴定较为困难。目前主要通过以下几个方面鉴定MSC［10］:①体外培养贴壁生长呈梭形;②用特异结合MSC细胞膜抗原的单克隆抗体直接鉴定;③能够自主增殖至少可以分化为3种以上间充质细胞系。本实验所培养的细胞由人骨髓取材，呈成纤维细胞样贴壁生长，培养至第3代时即可发现细胞可高表达CD90、CD105，而不表达CD34、CD11b，表明所分离培养的细胞是来源于骨髓、均一的MSC。

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。本实验对P1、P3、P5的MSC绘制生长曲线，发现MSC生长同样经历潜伏期、对数生长期和平台期，5代以内MSC增殖旺盛、具有较好的细胞活力，适合进行实验研究和临床应用。细胞周期分析显示，绝大部分细胞处于G0/G1期，少部分处于S+ G2/M期，与文献报道一致［9］，说明绝大部分细胞处于静止态，但保留自我更新和增殖能力，少部分处于功能态，符合干细胞的生长特性。

总之，密度梯度离心结合贴壁筛选法分离获得的人MSC纯度高(99%)，且该方法较简单、有效，因此是分离纯化人MSC的较好方法。

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