李洪伟，郭开今，周 冰，辛 兵，陈向阳，葛保健

(徐州医学院附属医院，江苏徐州221002)

人骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中存在的一类非造血组织干细胞，具有高度增殖和自我更新能力，并具有多向分化潜能，它不仅能分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等［1］，还可跨胚层分化为肝细胞［2］、神经细胞［3］、心肌细胞［4］，已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。由于骨髓中细胞成分比较混杂，MSC在骨髓中的含量极少，仅占骨髓中有核细胞的0.001%～0.01%，实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增。2009年3月～2010年2月，为寻找适宜MSC体外分离、培养和扩增方法，并分析其生物学特性，我们进行了相关实验。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 Percoll分离液(Pharmacia公司)，藻红蛋白(PE)标记鼠抗人CD90、CD105单克隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记鼠抗人CD34、CD11b单克隆抗体，RNase、碘化丙啶(PI)，牛血清白蛋。倒置相差显微镜，流式细胞仪。

1.2 MSC分离及培养方法

1.2.1 MSC的分离 无菌条件下从健康成人志愿者的髂骨处抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，轻轻摇匀，用DMEM培养基稀释1倍容积后，缓慢加入等量的Percoll分离液，2 500 r/min离心30 min，收集白膜层的单个核细胞，以PBS洗涤离心2次，按2×105/cm2密度接种于底面积为25 cm2的培养瓶中，加入完全培养基5 ml，置于5%CO2、37℃培养箱内孵育。

1.2.2 MSC的原代培养 接种后48 h进行首次半换液，弃未贴壁细胞，补充培养基;间隔2 d再次半换液，去除未贴壁细胞。以后细胞隔日洗涤、全量换液，使细胞逐渐纯化。

1.2.3 MSC的传代培养 原代培养细胞生长至80%～90%融合时，弃原培养液，PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶溶液消化3～5 min，倒置显微镜下观察大部分细胞逐渐趋于圆形，但尚未脱落时将溶液弃去，胎牛血清终止消化。……