马 萍,李鹏飞,刘丽宏,王淑民,丁春雷

(1.第二炮兵总医院药学部,北京 100088;2.首都医科大学附属北京同仁医院,北京 100730)

HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度

马 萍1,李鹏飞1,刘丽宏1,王淑民2,丁春雷1

(1.第二炮兵总医院药学部,北京 100088;2.首都医科大学附属北京同仁医院,北京 100730)

建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度。选用Zorbax Eclipse XDB-C 18色谱柱,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵为流动相,采用梯度洗脱进行分离,样品用V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,液-液萃取后进样,选用3200Q-Trap型质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行检测。替米沙坦线性范围为1.0～1 000.0μg/L,氢氯噻嗪线性范围为0.6～200.0μg/L,定量下限分别为1.0和0.6μg/L。准确度与精密度结果显示,方法日间、日内变异均小于15%,相对偏差分别为替米沙坦-5.6%～4.3%、氢氯噻嗪-6.3%～2.7%。替米沙坦和氢氯噻嗪的低、中、高3个浓度提取回收率均大于50%,稳定性较好。该方法可用于人体替米沙坦和氢氯噻嗪血药浓度的同时监测,以及复方制剂的人体药代动力学研究。

高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS);替米沙坦;氢氯噻嗪;药代动力学

替米沙坦(telmisartan)是一种非肽类、长效血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB),不仅具有持续稳定的降压作用,而且还有保钾、促尿酸排泌、降低尿蛋白的作用[1-2]。但是在所有的降压药中,即使针对轻度高血压患者,单一用药的有效率也仅为50%～60%[3],大多数高血压患者需要2种或以上的降压药才能达到目标血压(＜140/90 mmHg)。小剂量氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide,HCTZ)与 ABR联合使用,国外已有替米沙坦和氢氯噻嗪的复方制剂上市,用于治疗轻、中度高血压病,临床疗效好,安全性高,而且替米沙坦可以克服患者因使用氢氯噻嗪而引起的钾丢失。

有文献[4-5]报道同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪浓度的方法,但定量下限均较高。本实验拟建立 HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度,以满足临床同时监测替米沙坦和氢氯噻嗪的血药浓度,以及复方制剂的药代动力学和生物等效性的研究。

1 仪器与试药

3200Q-Trap型液相色谱-串联质谱仪:美国Applied Biosystem公司产品,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件;Agilent 1100高效液相色谱系统:美国Agilent公司产品,包括四元输液泵、自动进样器、切换阀。

替米沙坦对照品(批号 M060601,含量99.8%):宜昌长江药业有限公司产品;氢氯噻嗪对照品(批号100309-200702,含量 100%),单硝酸异山梨酯对照品(批号100694-200401):由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;空白人血浆:由第二炮兵总医院血液科提供。

2 溶液的配制

储备液:精密称取10.00 mg替米沙坦对照品,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成0.40 g/L替米沙坦储备液。精密称取10.00 mg氢氯噻嗪对照品,置于25 mL量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成0.40 g/L氢氯噻嗪储备液。

标准系列溶液:分别取1 mL替米沙坦储备液和0.2 mL氢氯噻嗪储备液,用乙腈稀释至4 mL,配制成含100 mg/L替米沙坦和20 mg/L氢氯噻嗪的母液。分别取适量替米沙坦氢氯噻嗪混合母液,用乙腈稀释至标准曲线所需的浓度,替米沙坦的浓度分别为 10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0、3 000.0、10 000.0μg/L,氢氯噻嗪的浓度分别为 2.0(定性考察)、6.0、20.0、60.0、200.0、600.0、2 000.0μg/L。分别取适量替米沙坦氢氯噻嗪混合母液,用乙腈稀释至质控样本所需的浓度,替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度分别为 100.0、1 000.0、8 000.0μg/L 和 20.0、200.0、1 600.0μg/L 。

内标:精密称取10.00 mg单硝酸异山梨酯对照品,置于100 mL容量瓶中,加入乙腈溶解,并稀释至刻度,配制成0.1 g/L储备液。取适量单硝酸异山梨酯储备液,用乙腈稀释至浓度为10.0 mg/L。

3 实验条件

3.1 色谱条件

色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C 18柱(150 mm×4.6 mm×5μm);流动相:乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液;梯度洗脱,梯度条件列于表1;流速1 200μL/min,分流比 1∶1;柱温 30 ℃;进样量25μL。

表1 梯度条件Table 1 The conditions of gradient elution

3.2 质谱条件

离子喷雾离子化源;离子喷射电压:-4 500 V;离子源温度:550 ℃;源内气体1(GS1,N2)压力:345 kPa;气体 2(GS2,N2)压力:449 kPa;气帘气体(N2)压力:138 kPa;扫描方式:多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)压力:Medium;替米沙坦、氢氯噻嗪、单硝酸异山梨酯解簇电压(DP)分别为-75、-48和-20 V;碰撞能量(CE)分别为 -30、-26和-20 eV;替米沙坦、氢氯噻嗪、单硝酸异山梨酯用于定量分析的离子反应分别为m/z513.3→469.5、m/z296.9→270.1和m/z190.1→62.0。

3.3 血浆样品处理

向10 mL EP管中加入500μL血浆样本,50μL内标单硝酸异山梨酯和50μL乙腈,振摇3次混匀。加入 3 mL提取试剂V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,涡流 1 min,振摇10 min,3 500 r/min离心5 min。将上清液转移至另一玻璃试管中,35℃氮气流下吹干,200 μL流动相复溶,进样25μL,LC-MS/MS分析。

4 分析方法确证

4.1 质谱分析

将替米沙坦、氢氯噻嗪和单硝酸异山梨酯贮备液用乙腈稀释至一定浓度,采用蠕动泵模式进样,按3.2项操作,进行碎片离子分析,相应的二级全扫描质谱图示于图1。

图1 替米沙坦(a)、氢氯噻嗪(b)和内标单硝酸异山梨酯(c)的[M-H]-二级全扫描质谱图Fig.1 Full-scan product ion spectra of[M-H]-for telmisartan(a),hydrochlorothiazide(b)and internal standard isosorbide mononitrate(c)

4.2 方法的专属性

取6名受试者的500μL空白血浆,分别按3.3项操作,进样25μL,得色谱图2a;将一定浓度的替米沙坦、氢氯噻嗪和单硝酸异山梨酯溶液加入空白血浆中,按3.3操作,得色谱图2b和2c;取受试者给药后收集的血浆样品,按3.3操作,得色谱图2d。结果表明,内源性物质不干扰替米沙坦、氢氯噻嗪和单硝酸异山梨酯的测定。

图2 LC-MS/MS法测定人血浆中替米沙坦(Ⅰ)、氢氯噻嗪(Ⅱ)和内标单硝酸异山梨酯(Ⅲ)的典型MRM色谱图Fig.2 Chromatograms of telmisartan(Ⅰ),hydrochlorothiazide(Ⅱ)and internal standard isosorbide mononitrate(Ⅲ)

4.3 线性关系考察

向10 mL EP管中加入500μL空白血浆样本,50μL内标单硝酸异山梨酯,50μL标准系列溶液(替米沙坦和氢氯噻嗪相对于血浆药物浓度分别为 1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0μg/L和 0.2(定性考察)、0.6、2.0、6.0、20.0、60.0、200.0μg/L),振摇 3 次混匀 ,加入 3 mL提取试剂V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,涡流1 min,振摇10 min,3 500 r/min离心5 min。将上清液转移至另一玻璃试管中,35℃氮气流下吹干,200μL流动相复溶,进样25 μL,LC-MS/MS分析。每浓度3样本,连续测定3天,以血浆中待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算,求得回归方程,即标准曲线。替米沙坦典型的回归方程为y=0.008 87x+0.004 76(r=0.997 5),氢氯噻嗪典型的回归方程为y=0.009 00x+0.001 28(r=0.996 7)。替米沙坦线性范围为1.0～1 000.0 μg/L,氢氯噻嗪线性范围为0.6～200.0μg/L。

4.4 准确度与精密度

按2项操作,制备低、中、高3个浓度(替米沙坦和氢氯噻嗪相对于血浆药物浓度分别为10.0、100.0、800.0μg/L 和 2.0、20.0、160.0 μg/L)的质量控制(QC)样品,每浓度6样本,连续测定3天。根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,根据QC样品结果计算该方法的准确度与精密度,结果列于表2和表3。结果显示,日间、日内变异均小于 15%,相对偏差为-4.5%～4.6%,精密度和准确度均较高,重现性较好。

表2 LC-MS/MS法测定血浆中替米沙坦的准确度与精密度(n=18)Table 2 The precision and accuracy of telmisartan in human plasma by LC-MS/MS

表3 LC-MS/MS法测定血浆中氢氯噻嗪的准确度与精密度(n=18)Table 3 The precision and accuracy of hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS

4.5 提取回收率和基质效应

取500μL空白血浆,按2项操作,制备低、中、高3个浓度样品(替米沙坦和氢氯噻嗪相对于血浆药物浓度分别为 10.0、100.0、800.0 μg/L和 2.0、20.0、160.0μg/L)的质量控制 ,每浓度3样本。同时另取500μL空白血浆,加入3 mL提取试剂V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液,涡流1 min,振摇10 min,3 500 r/min离心5 min。将上清液转移至另一玻璃试管中,向上清液中加入50μL相应浓度的标准溶液,50 μL内标,涡流混匀,35℃氮气流下吹干,200μL流动相复溶,进样25μL,LC-MS/MS分析。获得相应的峰面积,以每一浓度两种处理方法的测得浓度比值计算提取回收率,替米沙坦和氢氯噻嗪的低、中、高 3个浓度提取回收率分别为:(75.1±2.8)%、(75.9±3.9)%、(73.9±7.3)%和(51.5±2.8)%、(56.6±3.9)%、(56.45±5.9)%,内标提取回收率为(76.4±3.5)%。试验对替米沙坦、氢氯噻嗪和内标司的基质效应进行考察,以水代替空白血浆制备低、中、高浓度的基质效应考察样本,以质控样本检测浓度对基质效应样本检测浓度,计算相对偏差,相对偏差均小于10%,表明血浆无明显基质效应存在。

4.6 稳定性考察

分别进行长期(冰冻放置20 d)、3次冻融和室温放置3种稳定性的考察,将稳定性放置后和冻融后的测定结果与理论浓度进行比较,结果列于表4和表5。结果显示,所有稳定性试验中,测定值与添加值的相对偏差均小于10%,表明长期冰冻放置血浆样品,血浆样品反复冻融,以及分析测试过程中样品较为稳定,各种贮存条件不影响本方法对样品浓度进行准确测定。

4.7 方法学应用

各10名(男女各5人)健康受试者,分别口服1粒替米沙坦氢氯噻嗪胶囊(含替米沙坦40 mg,氢氯噻嗪12.5 mg),平均血药浓度-时间曲线示于图3。

表4 LC-MS/MS法测定替米沙坦的3种稳定性考察结果Table 4 Results of stabilities of telmisartan in human plasma by LC-MS/MS

表5 LC-MS/MS法测定氢氯噻嗪的3种稳定性考察结果Table 5 Results of stabilities of hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS

图3 10名健康受试者口服1粒替米沙坦氢氯噻嗪胶囊后,替米沙坦(a)和氢氯噻嗪(b)的平均血药浓度-时间曲线Fig.3 Mean plasma concentration versus time curves for telmisartan(a)and hydrochlorothiazide(b)in 10 healthy volunteers

5 讨论

用LC-MS/MS法测定血药浓度具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点,已普遍地应用于药物动力学研究。替米沙坦和氢氯噻嗪在人体血浆中浓度较低,且氢氯噻嗪不容易正离子化。本研究发现,替米沙坦在正离子和负离子化下均有较高的响应,氢氯噻嗪在负离子条件下的信号较高,氢氯噻嗪的平均相对分子质量297.739 8,最大峰度相对分子质量296.964 5,在进行氢氯噻嗪[M-H]-分子离子峰扫描时发现,m/z296.9响应最高,推测原因为氢氯噻嗪分子中含有2个S,S有较高的同位素峰分布,在低分辨率模式下的扫描范围为(296.9±0.7)u,同时可以兼顾最大峰度分子质量和同位素分子质量,因此选用响应最高的m/z296.9为氢氯噻嗪分子离子峰,信号较高的碎片离子m/z270.1为子离子。本研究所选色谱柱的孔径和内径均较大,可以达到较高的流速,由于质谱中的不同化合物并不需要完全的基线分离,采用较陡的梯度,未用酸或碱调节水相p H值,替米沙坦、氢氯噻嗪及内标单硝酸异山梨酯出峰窄而尖,保留时间比较接近,峰宽仅0.20 min,总分析时间5.0 min。流动相中加入乙酸铵可提高质谱离子化效率,从而提高信噪比,实验发现,在5 mmol/L乙酸铵浓度下信号最好。在梯度洗脱条件下,内标的选择相对来说比较容易,选用本研究室现有的对照品曲马多、司可巴比妥、单硝酸异山梨酯等进行考察,发现单硝酸异山梨酯负离子化响应较高且比较稳定,液相行为与替米沙坦和氢氯噻嗪比较一致,且峰型较好。常见的样品前处理方案有液-液萃取法、固相萃取法和沉淀蛋白法等,固相萃取法成本较高,蛋白沉淀的方法会带入较多污染,液-液萃取法比沉淀蛋白处理繁琐,但样本前处理过程中对样本有富集的作用。本实验为提高氢氯噻嗪的检测灵敏度,选用液-液萃取法。常用的液-液萃取溶剂有乙醚、二氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯以及V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液、V(正已烷)∶V(二氯甲烷):V(异丙醇)=300∶150∶15的溶液、V(乙酸乙酯)∶V(异丙醇)=95∶5的溶液等混合提取试剂。试验中,V(乙醚)∶V(二氯甲烷)=60∶40的溶液提取回收率较好且稳定,可以避免乙酸乙酯、异丙醇提取后复杂基质的影响。本研究所建立的检测方法中,替米沙坦和氢氯噻嗪的定量下限均能够检出达峰浓度的1/20或5个消除半衰期时的浓度,符合体内药代动力学的要求。由于替米沙坦在人体呈剂量非线性动力学特点,随着给药剂量的增加,体内浓度成倍升高,氢氯噻嗪呈剂量线性动力学特点。本研究建立的替米沙坦的线性范围为1.0～1 000μg/L,氢氯噻嗪的线性范围为0.6～200μg/L,考虑到了后续更高剂量研究的需要。

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Determination of Telmisartan and Hydrochlorothiazide in Human Plasma by HPLC-MS/MS

MA Ping1,LI Peng-fei1,LIU Li-hong1,WANG Shu-min2,DING Chun-lei1
(1.Pharmacy Department of the Second A rtillery General Hospital,Beijing100088,China;2.Beijing Tongren Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100730,China)

Telmisartan and hydrochlorothiazide in human plasma were determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Telmisartan,hydrochlorothiazide and the internal standard were extracted from plasma usingV(diethyl ether)∶V(dichloromethane)=60∶40,and separated on a Zorbax Eclipse XDBC 18 column using acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elu tion.Detection was carried out by multiple reaction monitoring(MRM)on a 3200Q-Trap LC-MS/MS system.The assay is linear over the range 1.0—1 000.0μg/L with a lower limit of quantitation of 5.0μg/L for telmisartan,and linear over the range 0.6—200.0 μg/L with a lower limit of quantitation of 0.6μg/L for hydrochlorothiazide.Intra-and inter-day precision are less than 15%.The relative deviations are in the range of-5.6%—4.3%for telmisartan,and -6.3%—2.7%for hydrochlorothiazide.The recoveries of telmisartan and hydrochlorothiazide are more than 50%,and stabilities are good.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLCMS/MS);telmisartan;hydrochlorothiazide;pharmacokinetics

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0043-07

2010-03-03;

2010-05-30

马 萍(1969～),女(汉族),甘肃天水人,副主任药师。E-mail:maping691009@126.com

李鹏飞(1980～),男(汉族),陕西眉县人,主任药师。E-mail:lee-pf@163.com