王国栋，徐科凤，黄韧，郑琰晶，陈 琳，林忠婷

（1.广东省实验动物监测所，广州 510260；2.青岛国家海洋科学研究中心，青岛 266071）

随着工农业生产的迅速发展，大量的废水和废物排放入海，其中的重金属在某一区域积累超过一定浓度时就会对海洋生物造成毒害作用。工业废水、生活污水排放、石油泄漏和降雨等是水体中重金属污染的主要来源［1］。重金属对海洋生物特别是鱼类毒害作用的研究已经引起了科学家们的迫切关注［2-4］。铜是生物体酶必需的活性因子，其在生物体内的含量甚微，但其浓度超过一定水平就会对生物体造成危害［5-7］。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）是常用的阴离子表面活性剂，大量存在于各类洗涤剂和去污粉中，随生活污水的大量排放，也会对环境造成一定的危害，同时它也是生化、免疫检测方面常用的蛋白质变性剂，毒性较大［8］，为美国试验材料协会（ASTM）推荐的生物毒性试验方法中常用标准毒物之一［9］。

裸项栉鰕虎鱼（Ctenogobius gymnauchen）为鲈形目（Perciformes）、鰕虎鱼亚目（Gobioidei）、鰕虎鱼科（Gobiidae）、鰕虎鱼亚科（Gobiinae）、栉鰕虎鱼属（Ctenogobius）的一种小型海洋鱼类，分布于我国沿海，南至琉球、菲律宾一带的礁石或沙泥底质浅水区［10］。因其个体小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力强，便于实验室内饲养管理。实验动物指由人工培育，来源清楚，遗传背景明确，对其携带的微生物和寄生虫实施监控，用于生命科学研究、药品与生物制品生产和检定、水环境污染评价以及其它科学研究的动物［11］。鉴于裸项栉鰕虎鱼具有以上特性，故具有较高的实验动物开发价值。

2007—2008年度，裸项栉鰕虎鱼被选为 GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验方法［12］修订版中的新增物种，用于生物毒性检测，因此有必要摸清其仔鱼对标准毒物的耐受性，从而了解其对有关毒物的敏感性。其中，关于裸项栉鰕虎鱼对Cu2+和SDS的适应能力在国内外尚未见报道。本实验以不同日龄的裸项栉鰕虎鱼仔鱼为研究对象，研究了仔鱼在不同浓度 Cu2+和SDS下的存活率，初步探讨了其对两种标准毒物的适应性，以期为新国标的修订提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验鱼的来源

裸项栉鰕虎鱼亲鱼采集于深圳大鹏湾沿岸的天然水域，在实验室内经人工培育达到性成熟，进行人工繁殖获得子代，作为本实验所用仔鱼。

1.2 实验鱼的驯化

实验用仔鱼培养箱为白色塑料整理箱（规格50 cm×30 cm×40 cm），实际用水量40 L。仔鱼孵出后投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）。驯养期间，实验用水为经过砂滤和活性碳处理的自然海水，盐度变化在32.6～35.3之间，pH变化在7.9～8.4之间，为保证培养箱中溶氧充足，用气泵24 h充气。光照和水温与室内自然节律一致，不进行人为控制，水温变化在 20.8℃ ～26.2℃之间。

1.3 实验设计

Cu2+急性毒性实验设置了8个 Cu2+浓度水平，为0.012、0.021、0.035、0.06、0.102、0.173、0.294和0.5mg/L，分别以 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8表示；5个不同日龄，为4、8、12、16和20 d，分别以D4、D8、D12、D16和D20表示，二者交叉形成了40个组合，每个组合设4个重复。实验过程中，按照6、12、24、48、72和96 h的时间间隔观察计数仔鱼的存活数。

SDS急性毒性实验设置了7个SDS浓度水平，为0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5和5 mg/L，分别以S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7表示，每个处理设四个重复，实验用鱼为4日龄，实验过程中，按照24、48、72和 96 h的时间间隔观察计数仔鱼的存活数。

1.4 实验管理

实验用养殖容器为1 L的玻璃烧杯，将驯养的裸项栉虾虎鱼仔鱼按照随机捞取的方式由自然海水转入以上各处理组，每杯放鱼10尾，实验期间保持正常换水，日换水量为1/3，换水前1 d将实验用水24 h充气。每天多次投喂褶皱臂尾轮虫（经小球藻和50 DE微囊轮虫强化饵料强化），密度为10 ind/m L左右。水温与光照条件与驯养期相同，不进行人为控制，实验期间各烧杯均不充气。

1.5 存活率的统计

按照实验设计时间点记录各烧杯仔鱼的存活数，并及时吸出死鱼。仔鱼死亡以鱼体发白、心脏停止跳动为准。

1.6 计算与数据分析

Cu2+急性毒性实验所得数据用方差分析及Duncan多重比较进行分析处理，以 P ＜0.05作为差异显著水平。所有数据的统计分析以 SPSS10.0软件进行。

SDS的急性毒性试验的数据处理采用概率单位法，根据死亡率查百分比与概率单位对照表得经验概率单位，以经验概率单位和浓度对数值作图，根据回归方程计算LC50［13］。

2 结果

2.1 Cu2+对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响

不同浓度下，不同日龄裸项栉鰕虎鱼仔鱼的存活率情况见表1，从中可以看出，Cu2+浓度对仔鱼的存活率有显著性影响（P＜0.05），随浓度的升高，各组仔鱼存活率显著降低（P＜0.05），当Cu2+浓度达到0.5 mg/L时，在实验开始6 h内，各组仔鱼均全部死亡。整体上，仔鱼的存活率随实验时间的延长而下降，而随日龄的增大存活率升高，其中96 h时S7处理组4 d仔鱼存活率为0，而此时相同Cu2+浓度下20 d组仔鱼的存活率高达42.5％。

表1 Cu2+对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响Tab.1 The effect of Cu2+on survival rate of Bareneck goby larva

2.2 Cu2+对不同日龄裸项栉鰕虎鱼仔鱼96 h的急性毒性影响

图1为96 h不同日龄裸项栉鰕虎鱼仔鱼在不同Cu2+浓度下的存活率，可以看出，各处理组仔鱼存活率随Cu2+浓度的升高而显著降低（P ＜0.05），0.060 mg/L～0.500 mg/L处理组尤为明显。整体上看，相同Cu2+浓度下，裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率随日龄的升高而升高，其中4日龄处理组存活率在各 Cu2+浓度下均比20日龄处理组低40％左右。

2.3 SDS对裸项栉鰕虎鱼仔鱼的LC50及95％置信限

图1 96 h时不同日龄裸项栉鰕虎鱼仔鱼在各Cu2+浓度下的存活率；图中同一日龄中带有不同字母的数据表示差异显著（P＜0.05）Fig.1 The survival rate of different daily age Bareneck goby larva at different Cu2+at 96 h；The data with different letter in the same daily agemeans significant difference each other（P＜0.05）

对裸项栉鰕虎鱼仔鱼SDS毒性处理结果列于表2，24、48、72和96 h的SDS半致死浓度分别为1.278、1.116、0.783和0.432 mg/L，95％的置信区间分别为0.737～2.215 mg/L、0.626～1.987 mg/ L、0.383～1.603 mg/L和0.292～0.637 mg/L。

3讨论

表2 SDS对裸项栉鰕虎鱼仔鱼24 h、48 h、72 h和96 h的LC50及95％置信限Tab.2 LC50 and 95％confidence limits of Bareneck goby larva at different SDS at 24 h、48 h、72 h and 96 h

3.1 Cu2+对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响

鱼类的早期生活史阶段是对污染物比较敏感的阶段［14］。关于重金属对鱼类早期生活史阶段的毒害效应，已有学者作了一定的工作［15-18］。了解重金属对海洋鱼卵孵化和仔稚鱼成活的毒性规律，对于防止海洋污染，保护水产资源和发展绿色健康海水养殖业具有重要的意义。重金属对小型鱼类的毒性影响研究主要集中在斑马鱼、绵羊头鲦鱼、月银汉鱼、日本青鳉（Oryzias latipes）及黑头软口鲦（Pimephales promelas）上，这几种鱼都是毒性试验方法中常用的受试鱼，研究证明这些鱼在早期阶段对重金属的敏感性普遍都高于成鱼期［19-24］。

国内外学者在Cu2+对鱼类的致毒机理方面进行过相关研究。Mazon等［25］指出 Cu2+可引起美洲热带鱼Prochilodus scrofa鳃的扁平上皮细胞和氯细胞增生肥大，血-水屏障增厚，而导致鱼的呼吸困难甚至死亡。由于Cu2+抑制鳃Na+-K+-ATPase活性或者是杀死鳃上的起离子传输作用的成熟氯细胞群［26］从而破坏了鱼体水气交换机制［27］。Laurén等［28］报道 55μg/L Cu2+会使得虹鳟鱼（Sa lmon gairdneri）鳃丝 Na+-K+-ATPase酶活性下降33％，鳃的能量利用和酸调节功能丧失或受阻。Nemcsók等［29］报道虹鳟鱼在2mg/L Cu2+溶液中暴露24 h后，血液中 ASAT（天门冬氨酰转氨酶）和ALAT（丙氨酸转氨酶）和AChE（乙酰胆碱酯酶）活力分别增加2倍、4.5倍和1.2倍，肝糖水平增加3.2倍，表明鳃、肾脏和肝脏受到损伤。Gail等［30］报道莫桑比克罗非鱼（Oreochrom is mossambicus）在0.4mg/L Cu2+暴露28d后，血液白细胞数量增加而红细胞数量减少，且渗透调节能力受到抑制，说明Cu2+对其代谢过程产生了毒性作用。霓红鱼（Paracheirodom innesi）对Cu2+的吸收与环境暴露浓度呈线性关系，环境暴露浓度越高，进入鱼鳃、肌肉、肝脏中的重金属离子量越多［31］。不同形态的Cu2+在彩虹方头鱼鱼体和鱼鳃中的积累量均随水相游离 Cu2+浓度增高、暴露时间增长而增加［32］。本实验结果显示，在本实验条件下裸项栉鰕虎鱼仔鱼的存活率受 Cu2+影响显著，对 Cu2+的毒性具有很高的敏感性。毒性敏感性与仔鱼的日龄负相关：日龄愈小，敏感性愈高。

3.2 SDS对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响

作为为美国试验材料协会推荐的生物毒性试验方法中常用标准毒物之一，SDS对鱼类具有一定的毒性。SDS对鱼类的96 hLC50通常都在0.59～38 mg/L［33-35］。值得注意的是，检测条件不同，可能导致SDS的毒性数据出现明显的差异。例如，在Fogels［33］的试验中，SDS对虹鳟的96hLC50为4.62 mg/L，而Buhl等［34］测的数值则为24.9 mg/L，远高于前者，Vijayan等［35］测得的数据甚至达到38 mg/ L。这种差异主要归因于测定温度和鱼类发育阶段的不同。另外，实验中采用的观测指标不同也会对SDS的毒性数据产生影响。例如，Chen等［36］在用日本青鳉（Oryzias latipes）评估电镀废水的毒性时，将SDS作为参比毒物，获得SDS对幼鱼的96h LC50为12.5 mg/L。SDS对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的48 h和96 hLC50分别为11.8 mg/L和5.2 mg/L，且 SDS对草鱼抗氧化酶有显著影响，对草鱼鳃、血清和肾脏等细胞组织有明显的毒性效应［37］。本实验结果 24 h～96 h的 LC50变化在0.4315～1.2777 mg/L之间，低于上述各鱼的SDSLC50浓度，这可能与实验对象的种间差异有关，本实验对象裸项栉鰕虎鱼为海水性鱼类，且均为初孵仔鱼，故相对具有更高的敏感性，这也正是新国标选用其作为标准生物的原因之一。根据化学农药环境安全评价试验准则［38］，本实验SDS对裸项栉鰕虎鱼的毒性属于高毒性～中毒性。有研究表明国标GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验方法中选用的标准物种中，卤虫（Artem ia parthenogenetica）对SDS 96h的 LC50为13.9 mg/L，蒙古裸腹蚤（Moina mongolica Daday）对 SDS 72 h的 LC50为 3.5 mg/L［39］，脊尾白虾（Palaemon carincauda）仔虾对 SDS 96 h的 LC50为14.3 mg/L［40］。本实验对象裸项栉鰕虎鱼仔鱼与上述标准生物相比具有更高的生物敏感性，且随日龄的变化其耐受力增长，故裸项栉鰕虎鱼仔鱼被用于生物毒性检测，具有更宽的适用范围。

3.3 裸项栉鰕虎鱼仔鱼对标准毒物耐受性的评价

裸项栉鰕虎鱼被选为国标“海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验方法”修订版中的新增物种，用于生物毒性检测，需要其对相关毒性物质具有较宽的敏感性，以便对多种不同毒性程度的海洋石油勘探开发污染物进行毒性评估。本实验条件下，裸项栉鰕虎鱼仔鱼恰恰对标准毒物显示出了很高的敏感性，验证了不同日龄仔鱼用于海洋生物毒性检测的适宜性。即，选用不同日龄的裸项栉鰕虎鱼仔鱼就能够实现对不同毒性污染物的生物毒性检测。因此，裸项栉鰕虎鱼仔鱼用于海洋石油勘探开发污染物生物毒性检测是切实可行且适宜的。

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