邓小鹿， 彭 镜， 何 芳， 杨丽芬， 吴丽文， 尹 飞

(中南大学湘雅医院儿科，湖南长沙410008)

肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)主要由单核细胞和巨细胞产生，在介导中枢神经系统感染的炎症过程中起着重要作用。本实验室前期研究证实，感染性脑水肿大鼠脑组织的TNF－α含量明显增高，与脑水肿的严重程度呈正相关［1］;Rho激酶抑制剂Y－27632可以减轻TNF－α导致的脑微血管内皮细胞通透性增高［2］。同时，已有研究显示RhoA/Rho激酶信号通路是调控内皮细胞屏障功能的重要环节，其中RhoA的活性由Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rho guanine nucleotide exchange factors， RhoGEFs)催 化。p115RhoGEF是第一个被发现联系G蛋白偶联受体和Rho家族的RhoGEFs，介导多种刺激因素如凝血酶、溶血凝脂酸、血栓素－2对RhoA的活化［3］。因此，我们认为p115RhoGEF可能也参与了TNF－α对RhoA的调控，而目前未见相关文献报道。本研究检测了TNF－α刺激小鼠脑微血管内皮细胞不同时点RhoA活性和蛋白表达水平，并通过siRNA抑制p115RhoGEF表达，探讨其在TNF－α对RhoA活性调控中的作用。

材料和方法

1 材料

小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3由美国芝加哥大学章坚教授馈赠，RhoA活性检测试剂盒购自Cytoskeleton，DMEM高糖培养基购自Thermo，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司，重组人TNF－α购自Sigma，兔抗RhoA单克隆抗体购自CST，山羊抗p115RhoGEF多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG购自Santa Cruz，p115RhoGEF siRNA由上海吉凯基因技术有限公司合成。其余生化试剂为国产分析纯试剂或进口分装。

2 方法

2.1 细胞培养 应用 DMEM(含 10%FBS)培养液，在37℃、5%CO2培养箱条件下培养bEnd.3细胞，每3 d按1∶2的比例传代，每日于倒置相差显微镜下观察细胞形态与生长状态，1－2 d更换1次培养液。

2.2 siRNA转染 参考文献［4］合成p115RhoGEF siRNA。合成引物序列如下:正义链5'－CAUACCAUCUCUACCGACGtt－3';反义链5'－CGUCGGUAGAGAUGGUAUGtt－3'。……