刘奇 武有聪 袁有华 白丽 牛坤

口腔白色假丝酵母菌毒力因子与随机扩增多态性DNA条带的多元回归分析

刘奇1武有聪1袁有华1白丽1牛坤2

（1.大理学院基础医学院 医学微生物学及免疫学教研室；2.大理学院 研究生处，大理 671000）

目的 探讨白色假丝酵母菌毒力因子与随机扩增多态性DNA（RAPD）电泳条带之间的关系，构建多元回归模型。方法 采用体外法对92株白色假丝酵母菌的细胞外磷脂酶活性、分泌性蛋白酶活性、芽管生成率、对口腔黏膜细胞的黏附力进行检测；并通过RAPD方法进行扩增，电泳后分析扩增条带。对上述毒力因子和电泳条带进行多元回归分析。结果 白色假丝酵母菌的细胞外磷脂酶活性与RAPD扩增后350、450、650和1300 bp 4个条带明显相关（P＜0.05）；分泌性蛋白酶活性与350、1 200 bp 2个条带明显相关（P＜0.05）；芽管生成率与400、550 bp 2个条带明显相关（P＜0.05）。结论 白色假丝酵母菌RAPD部分电泳条带与部分毒力因子的强弱有关，其所含基因信息可能参与该菌毒力因子的调节。

白色假丝酵母菌； 毒力； 随机扩增多态性DNA； 多元回归

白色假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）是目前深部真菌感染中最常见、最主要的病原体之一，该菌深部感染的病死率为68.90%[1]。快速准确地判断白色假丝酵母菌的毒力，不仅为该病的诊断、治疗和预防提供依据，而且对该病的流行病学调查亦有重要的意义。本实验对92株白色假丝酵母菌的细胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成能力、对口腔黏膜细胞的黏附力进行测定，采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术扩增并电泳，进行多元回归分析，并构建回归模型，以探索白色假丝酵母菌各毒力因子与各RAPD电泳条带之间可能存在的关系。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

试验菌株均为分离自云南大理地区的人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）阳性人群和健康携带人群的口腔假丝酵母菌。健康携带人群排除HIV阳性者、肿瘤患者、免疫缺陷病患者、器官移植患者、妊娠者、长期接受治疗者和口腔疾病患者。菌株经形态染色、培养特性鉴定、芽管形成实验、假菌丝及厚膜孢子形成实验、YBC（yeast biochemistry card）酵母鉴定卡及CHROMagar培养基培养综合鉴定，确定为白色假丝酵母菌，其中来自HIV阳性人群53株，来自健康携带人群39株。

1.2 白色假丝酵母菌细胞外磷脂酶活性的测定[2]

待测白色假丝酵母菌接种于SDA琼脂培养基，35℃培养24 h，集菌，用无菌生理盐水调整菌悬液密度至0.5个麦氏单位（1×106～2×106cfu·mL-1）。

在卵黄培养基上放置直径6mm的圆形无菌滤纸片，滴加6μL白色假丝酵母菌悬液于滤纸片上（保证菌悬液在培养基上呈圆形）。每个菌株在不同平板上做2个副本，35℃孵育5 d后观察结果。环绕滤纸片有菌落生长，透射光下菌落四周产生界限清晰、白色致密的沉淀环者为磷脂酶阳性。磷脂酶活性以Pz值表示。Pz=菌落直径/总直径。总直径为菌落和沉淀环直径之和。分别计算每一菌株2个备份的Pz值，再计算其平均值，作为该菌株的Pz值。Pz值的大小与白色假丝酵母菌细胞外磷脂酶的活性大小成反比。

1.3 白色假丝酵母菌分泌性蛋白酶活性的测定[3]

菌悬液密度同上。用微量移液器取配好的菌悬液6μL，滴于牛奶平板培养基的滤纸片上，使其形状呈圆形。每株菌在不同平板上做2个副本。平板置于35℃培养48 h，产生分泌性蛋白酶的菌落周围出现一透明圈。测量透明圈直径，计算酶活性（Pa值）。Pa=菌落直径/总直径。总直径为菌落和透明圈直径之和。每个菌株的Pa值为2份测定值的平均数。Pa值愈小，酶活性愈强，Pa=1者酶活性为阴性。

1.4 白色假丝酵母菌黏附力的测定[4]

白色假丝酵母菌在SDA培养基上35℃培养过夜，制作菌悬液，用无菌PBS缓冲液调整菌液密度至4个麦氏单位（1×107～2×107cfu·mL-1）。

用无菌棉拭子在健康人口腔黏膜表面反复轻擦，收集颊上皮细胞，分散于10mL无菌PBS（pH=7.4）中，于涡旋震荡器上震荡1min，洗去附着的微生物，2 500 g离心10min，弃上清液；加入10mL无菌PBS，震荡，同上离心，弃上清液，沉淀重悬于2mL无菌PBS中，用血球计数仪计数，调整颊细胞密度为每毫升105个。

将0.5mL颊上皮细胞加入0.5mL菌悬液中，每个菌株做2个副本，以不加白色假丝酵母菌的颊上皮细胞作为对照，37℃摇床中（75 r·min-1）孵育1 h后加入无菌PBS至5mL，用聚丙烯微孔滤膜（孔径20μm）滤除游离的白色假丝酵母菌。再用无菌PBS洗去未被颊上皮细胞黏附的白色假丝酵母菌，然后将滤膜有颊上皮细胞的一面印在玻片上，15 s后移去滤膜，空气中晾干后进行革兰染色，将每张滤膜的印迹在光镜下（400×）观察。观察50个颊上皮细胞（只观察单个的颊上皮细胞，不观察重叠、丛集或折叠的颊上皮细胞），计数黏附的白色假丝酵母菌数（未脱离白色假丝酵母菌母细胞的子细胞不计入），计算每一菌株各个副本的平均黏附数（50个颊上皮细胞上黏附的白色假丝酵母菌个数/50），再计算每个菌株的平均黏附数，定义为H值。H值与白色假丝酵母菌的黏附力大小成正比。

1.5 白色假丝酵母菌芽管生成率的测定[5]

待测菌悬液（1×107～2×107cfu·mL-1）各取250 μL，分别加入0.5mL灭活混合人血清，37℃孵育2 h后用4%甲醛固定，涡旋混匀10 s，压滴法制片。光镜下（400×）观察300个白色假丝酵母菌细胞，胞体上有出芽，且与胞体间无缢缩环者为芽管生成阳性。芽管生成率定义为A，其中A（%）=[出芽细胞数/（出芽细胞数+孢子数）]×100%。

1.6 RAPD分析[6]

主要试剂包括100 bp DNA Marker、DNA扩增试剂盒和随机引物，均购于上海生工生物工程有限公司。白色假丝酵母菌RAPD分析方法：提取白色假丝酵母菌DNA，以P2引物（核苷酸序列为5’-GCAGATGCAC-3’）进行RAPD，以双蒸水代替引物作为空白对照。RAPD扩增产物采用质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳，Gene Genius全自动凝胶成像系统（Syngene公司，英国）摄像，分析扩增条带。

2 结果

2.1 白色假丝酵母菌毒力情况

92株白色假丝酵母菌中，细胞外磷脂酶阳性的共79株，占85.87%，其Pz值为0.52±0.17；分泌性蛋白酶阳性者87株，占94.57%，Pa值为0.45±0.15；对口腔黏膜细胞的黏附数为34.13±26.78；平均芽管生成率为15.24%±14.47%。

2.2 RAPD结果

采用随机引物P2对所有菌株进行RAPD扩增，扩增条带数在0～11之间，最小200 bp，最大1 700 bp。

2.3 白色假丝酵母菌毒力因子与RAPD条带的多元回归模型

细胞外磷脂酶与RAPD条带的多元回归模型以Pz值倒数（1/Pz）为因变量；分泌性蛋白酶模型以Pa值倒数（1/Pa）为因变量；黏附力模型以H值为因变量；芽管生成率模型以百分率A为因变量。所有模型中的自变量均为RAPD电泳条带（无条带为0，有条带为1），采用逐步回归方法建立回归模型。结果在白色假丝酵母菌的4项毒力因子中，仅细胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成率3项与RAPD条带的多元回归模型构建成功（表1）。各回归方程如下：1/Pz＝2.142-1.006（band 350）-0.748（band 450）+0.485（band 650）-1.028（band 1 300），复相关系数R＝0.628，决定系数R2＝0.395；1/Pa＝2.406-0.551（band 350）-1.106（band 1 200），复相关系数R＝0.558，决定系数R2＝0.311；A＝0.188-0.123（band 400）-0.128（band 550），复相关系数R＝0.388，决定系数R2＝0.151。

表 1 白色假丝酵母菌毒力因子与RAPD条带的多元回归分析Tab 1 Multip le regression for virulence factors of S.albicans by RAPD bands

3 讨论

白色假丝酵母菌可以寄居在人类黏膜表面而不致病，一旦宿主与菌株间的平衡关系被破坏就会发生假丝酵母菌病。一方面是由于宿主的免疫功能下降，另一方面则是菌株的毒力作用。虽然白色假丝酵母菌的毒力因子目前尚无公认而明确的概念，但黏附力、二相性转换、分泌性蛋白酶、细胞外磷脂酶等已被认为是导致感染的重要毒力因子。

RAPD是近年发展起来的一种新的假丝酵母菌种间及种内的分型方法。通过选择单条或多条片段长度为8～10个碱基的寡核苷酸引物，用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法对标本进行随机扩增，经琼脂糖电泳分离出不同长度的片段构成PCR指纹图谱，从而对菌株进行鉴定及分型。该技术以分型率高、分辨力强、简便快速、技术要求低、无需大量制备DNA等优点，被广泛应用于生物分类鉴定、临床标本诊断、基因定位、谱系分析、多态性分析和流行病学调查等多个领域。

本研究采用RAPD技术，构建白色假丝酵母菌各毒力因子与RAPD条带的回归模型，但仅细胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成率3项因子构建成功。根据构建的回归模型可以发现：细胞外磷脂酶活力主要与350、450、650和1300 bp 4条RAPD条带有相关性（P＜0.05），其中与650 bp条带呈正相关，与350、450和1 300 bp 3个条带呈负相关；分泌性蛋白酶活性与350、1200 bp 2个条带呈负相关（P＜0.05）；芽管生成率与400、550 bp 2个条带呈负相关（P＜0.05）。3个模型决定系数均不高，也提示影响白色假丝酵母菌毒力的因素较多，但这些条带的有无对间接判断毒力有着重要意义。另外，本研究结果也提示：这些条带中可能存在与白色假丝酵母菌毒力因子的表达与调节有关的基因，条带中的基因序列及其表达产物对白色假丝酵母菌毒力的作用值得进一步探讨。

[1] 任南,文细毛,王洁如.白色念珠菌致病机制的研究进展[J].中国感染控制杂志,2003,2（2）：157-158.

Ren Nan,Wen Ximao,Wang Jieru.Research progress in the pathogenic mechanism of Candida albicans[J].Chin J Infect Control,2003,2（2）：157-158.

[2] 曾昕,陈谦明,聂敏海,等.口腔扁平苔藓者白色念珠菌检出率及分离株的磷脂酶活性研究[J].中国微生态学杂志,2004,16（2）：89-90.

Zeng Xin,Chen Qianming,Nie Minhai,et al.The oral Candida albicans isolation rate of patients with OLP and phospholipase activity of isolates[J].Chin JMicroecology,2004,16（2）：89-90.

[3] 曹岩,张巨,沙春蕊,等.白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系[J].吉林大学学报：医学版,2007,33（3）：483-487.

Cao Yan,Zhang Ju,Sha Chunrui,et al.Relationship between activity and virulence of secretory acid proteinase and extracellular phosphlipase of Candida albicans[J].J Jilin University：Medicine Edition,2007,33（3）：483-487.

[4] 周俊英,郑芳,郭清莲.白色念珠菌25S rDNA基因分型及致病性分析[J].临床检验杂志,2009,27（3）：187-189.

Zhou Junying,Zheng Fang,Guo Qinglian.Genotyping of Candida albicans based on 25S rDNA and its relationship to drug susceptibility[J].Chin J Clinical Laboratory Science,2009,27（3）：187-189.

[5] 李凡,刘晶星.医学微生物学[M].7版.北京：人民卫生出版社,2008：340.

Li Fan,Liu Jingxing.Medical microbiology[M].7th ed.Beijing：People’s Medical Publishing House,2008：340.

[6] 武有聪,白丽,袁有华,等.HIV相关性口腔念珠菌RAPD多态性分析[J].微生物学通报,2009,36（5）：728-734.

Wu Youcong,Bai Li,Yuan Youhua,et al.Analysis on RAPD genetic polymorphism of HIV related oral Candida species[J].Microbiology,2009,36（5）：728-734.

Establishment of multiple regression model for virulence factors of Saccharomyces albicans by random am p li- fied polymorphic DNA bands

Liu Qi1,Wu Youcong1,Yuan Youhua1,Bai Li1,Niu Kun2.（1.Dept.of Medical Microbiology and Immunology,School of Basic Medicine,Dali College,Dali671000,China;2.Postgraduate Administration Office,Dali College,Dali671000,China）

Objective To research the relationship between the virulence factors ofSaccharomyces albicans（S.albicans） and the random amplified polymorphic DNA（RAPD） bands of them,and establish the regression model by multiple regression analysis.Methods Extracellular phospholipase,secreted proteinase,ability to generate germ tubes and adhere to oralmucosal cells of 92 strains ofS.albicanswere measuredin vitro;RAPD-polymerase chain reaction（RAPDPCR）was used to get their bands.Multiple regression for virulence factors ofS.albicansand RAPD-PCR bands was established.Results The extracellular phospholipase activity was associated with 4 RAPD bands:350,450,650 and 1 300 bp（P＜0.05）;secreted proteinase activity ofS.albicanswas associated with 2 bands:350 and 1 200 bp（P＜0.05）;the ability of germ tube produce was associated with 2 bands:400 and 550 bp（P＜0.05）.Conclusion Some RAPD bands will reflect the virulence factors ofS.albicansindirectly.These bands would contain some importantmessages for regulation ofS.albicansvirulence factors.

Saccharomyces albicans； virulence； random amplified polymorphic DNA； multiple regression

R 781.5＋4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.06.021

1000－1182（2011）06-0643-03

2010-09-30；

2011-02-22

国家自然科学基金资助项目（30260005）；大理学院高层次人才基金资助项目（KY430440）；大理学院科研基金青年基金资助项目（KYQN2010-51）

刘奇（1982—），男，河南人，讲师，硕士

白丽，Tel：0872-2257115

（本文编辑 吴爱华）

·综 述·