郭云翮， 李 祥， 薄五海， 王艳红 (山西省大同大学医学院外科教研室， 大同 037009)

鞘内联合应用奈福泮和新斯的明对切口痛大鼠的镇痛效应

郭云翮， 李 祥， 薄五海， 王艳红 (山西省大同大学医学院外科教研室， 大同 037009)

目的 观察鞘内联合应用盐酸奈福泮和新斯的明的镇痛作用。 方法 在大鼠切口疼痛模型上结合鞘内置管技术，采用累积疼痛评分法评定大鼠疼痛行为;采用序贯法分别使用不同剂量奈福泮、新斯的明进行鞘内注射以获得量效曲线及半效剂量(ED50)，鞘内联合应用不同比例的ED50剂量获得联合用药时药物各自的半效剂量以分析两药的相互作用。 结果 ①据公式得出鞘内注射 50 －150 μg的奈福泮的 ED50值为 82.64 μg，95%可信区间为 80.4 －97.4 μg;鞘内注射剂量 1 －10 μg的新斯的明的 ED50值为 8.36 μg，95%可信区间为 6.68 －10.70 μg;鞘内合用 1/2，1/4，1/8，1/16 ED50的奈福泮和新斯的明各自的 ED50值分别为:奈福泮 10.93 μg，95%可信区间 6.83 －17.49 μg;新斯的明 1.05 μg，95%可信区间为 0.66 －1.68 μg。②奈福泮和新斯的明单独应用及联合应用对切口疼痛大鼠均产生剂量依赖型的镇痛作用。③据Tallarida等提出的Isobologram作图方法分析得出新斯的明和奈福泮的相互作用是协同的。 结论 ①奈福泮50－150 μg、新斯的明5－15 μg鞘内应用均可产生剂量依赖性的镇痛作用。②奈福泮和新斯的明的镇痛作用存在协同作用。

奈福泮; 新斯的明; 序贯法; 鞘内注射; 切口疼痛; 大鼠

奈福泮(nefopam)是一种新型非麻醉性镇痛药，其作用与阿片受体无关;新斯的明(neostigmine)是一种胆碱酯酶抑制剂，近几年实验和临床研究［1］均显示鞘内注射(intrathal injection)具有明显的抗伤害作用和镇痛作用。在脊髓水平，新斯的明的镇痛作用与阿片类药、局麻药、可乐定均有协同效应［2］，而与奈福泮联用无相关报道。奈福泮与新斯的明在脊髓水平的镇痛作用及相互作用怎样，是否具有协同效应，是否可以作为联合镇痛药物作用于临床治疗术后疼痛是非常有意义的值得研究的问题。本研究的目的就是观察鞘内联合应用奈福泮和新斯的明对切口术后大鼠的镇痛效应及其相互作用。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂 奈福泮注射液(nefopam hydrochloride injection，湖北同济奔达鄂北制药有限公司);新斯的明(neostigmine，上海信谊金朱药业有限公司);异氟醚(isoflurane，上海朗源化工有限公司);麻醉机(德国Drager麻醉机，德尔格医疗设备有限公司)

1.2 鞘内置管的模型制备 体重250－300 g的雄性SD大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供，以5%的水合氯醛0.6 ml/kg腹腔注射麻醉后，按杨建平法［3］在大鼠蛛网膜下隙植入PE10聚乙烯导管(实验药物均经所埋导管注入蛛网膜下隙)，妥善固定，术毕给予20 g/L利多卡因注射液20 μl，凡是10 s内两后肢不能负重、拖地以及针刺小腿无回缩等逃避反应，16－20 min以后又恢复负重者为实验动物，饲养5 d后用于实验。

1.3 切口疼痛模型的建立 大鼠吸入浓度为1.4%的异氟醚麻醉后，将其左后爪进行消毒，按Brennan等［4］法从足底近端0.5 cm处向趾部作一长约1 cm的切口。切开皮肤，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，保持肌肉的起止及附着完整，按压止血，用细线缝合皮肤共两针即成切口疼痛模型。

1.4 动物分组 采用Tallarida等［5］提出的Isobologram简易作图的分析方法，先分别求出奈福泮与新斯的明单独使用时的ED50，再将此两药的1/2，1/4，1/8，1/16 ED50合用，便可求出二者合用时的各自的ED50，用二药合用时的ED50与二药单独使用时的各自的ED50，作Isobologram图，看是否存在协同作用。

根据预实验及确定的有效指标，鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值可能在5－15 μg范围，以此范围为准，采用等比系数(r)为1.316，设立 5 个剂量即 5，6.6，8.7，11.4，15 μg，取20只大鼠用于序贯实验为新斯的明组;鞘内给予奈福泮对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值可能在50 －150 μg 之间，采用等比系数(r)为1.316，设立5个剂量即 50，65.8，86.6，113.9，150 μg，取 20 只大鼠用于序贯实验为奈福泮组。分别求出奈福泮和新斯的明的 ED50后，将二药的 ED50的1/2，1/4，1/8，1/16合用，仍取20只大鼠采用序贯法求出二药合用时各自的ED50为合用组。另有一组是生理盐水对照组，5只大鼠。所有大鼠均按随机分配原则入组，而给药时采用单盲法。

1.5 序贯法 序贯法［5］是将小鼠一只一只序贯地进行实验。先进行对照组实验，再行奈福泮、新斯的明组、合用组实验。以实验组大鼠累积疼痛评分比对照组大鼠累积疼痛评分减少50%为镇痛有效指标。奈福泮、新斯的明组大鼠均首先从最大剂量开始，若有效则下一只用低一级的剂量，若无效则下一只用高一级的剂量，如此序贯进行，直至试验至预先已决定好的动物数为止，据公式计算出ED50值及其95%可信区间(CI)。

1.6 行为学实验 采用累积疼痛评分法［4］评定疼痛强度，待大鼠手术清醒后观察两后爪着地及负重情况，后爪被压迫发白表示负重，如后爪翘起不着地，记2分;如后爪着地但不负重，记1分;如后爪着地并且负重，记0分。从术后1 h起每5 min观察1次，每次1 min，以1 min内最常采取的姿势为标准，共观察1 h，以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分(1－24分)。

1.7 统计学分析所得数据采用±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析。累积疼痛评分的比较作单因素方差分析;组间比较先作方差齐性检验，若方差齐则采用最小显著法(LSD法)，若方差不齐，则用秩和检验比较，P＜0.05为差异有统计学意义;理论上相加效应时的ED50值与实测的ED50值采用t检验进行比较，若实测值低于理论值，且X轴和Y轴上差异的P值均小于0.05，则认为两种药物之间具有协同效应。

2 结果

2.1 奈福泮、新斯的明单独与联合应用的ED50值及95%的可信区间 对照组累积疼痛评分值17±2.9，以累积疼痛评分8.5为镇痛有效指标做出序贯实验，各组序贯实验，ED50及95%可信区间结果见表1－6。根据计算公式得出奈福泮 ED50为88.5 μg，95% 可信区间为 80.4 － 97.4 μg;新斯的明的ED50为 8.36 μg，95%可信区间为 6.68 －10.70 μg;两药合用时新斯的明的 ED50为 1.05 μg，95% 可信区间为 0.66 －1.68 μg;奈福泮的 ED50为 10.93 μg，95%可信区间为6.83 －17.49 μg。

表1 鞘内单独应用奈福泮序贯实验结果Tab 1 Sequential experiment results of intrathecal nefopam

表2 鞘内单独应用奈福泮的ED50及95%可信区间Tab 2 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal nefopam

表3 鞘内单独应用新斯的明序贯实验结果Tab 3 Sequential experiment results of intrathecal neostigmine

表4 鞘内单独应用新斯的明的ED50及95%可信区间Tab 4 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal neostigmine

表5 鞘内奈福泮与新斯的明联合用药序贯实验结果Tab 5 Sequential experiment results of intrathecal administration of both nefopam and neostigmine

表6 鞘内奈福泮与新斯的明联合用药时奈福泮和新斯的明各自的ED50及95%可信区间Tab 6 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal nefopam and neostigmine after combined administration

2.2 序贯法测定的累积疼痛评分 对照组大鼠的术侧足常翘起，偶尔着地，但极少负重;奈福泮组、新斯的明组及合用组术侧足均可着地，并且负重。对照组累积疼痛评分19±4，其他组累积疼痛评分结果见表7。与对照组相比，术后鞘内注射奈福泮组、新斯的明组及合用组均可明显降低累积疼痛评分(P＜0.05)，各用药组无明显差异。由表7所示可认为奈福泮和新斯的明单独应用及联合应用对切口疼痛大鼠均产生剂量依赖型的镇痛作用。

表7 各组中不同剂量的累积疼痛评分值Tab 7 Cumulative pain scores of rats after different doses of drugs in 3 groups

2.3 Isobologram分析 根据Isobologram方法和已经求得的实验值，可作出Isobologram图。由图1可见，实验点(10.93，1.05)明显在理论累加等位线的下方，且其95%可信区间不与理论累加点重合，理论上相加效应时的ED50值与实测的ED50值比较后，X轴上P＜0.05;Y轴上P＜0.05，均有统计学差异。因此可以认为盐酸奈福泮和新斯的明的相互作用是协同的。

图1 Isobologram方法检测奈福泮和新斯的明的相互作用Fig 1 Isobologram for analyzing the interaction of nefopam and neostigmine

3 讨论

序贯法是一种探讨用药剂量或浓度的经典方法［6］。本研究采用此方法探讨鞘内注射奈福泮、新斯的明对切口疼痛大鼠产生镇痛作用的有效剂量。从实验结果可看出，鞘内给予奈福泮、新斯的明及合用组剂量后动物阳性和阴性变化比较集中，故结果重复性较好，可靠。

本实验采用的外周伤害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型，此模型是由Brennan等［3］提出的，一直延续至今。施行切口手术的大鼠表现自发性疼痛行为，与临床上外科手术和术后状态一致。

本实验发现奈福泮和新斯的明鞘内单独应用及联合应用对切口疼痛大鼠均产生剂量依赖型的镇痛作用。另外一个重要发现是，在大鼠切口疼痛模型中鞘内联合应用新斯的明和奈福泮的镇痛作用具有协同效应。加强药物相互作用的可能性主要包括以下两种情况:①降低药物的清除率。尽管在本研究中对药物的重分布情况并未进行研究，但联合用药组药物的作用时间并未发生明显的变化，所以不认为药物的清除率发生改变。②受体的功能性相互作用。如存在受体之间的功能性相互作用，那么新斯的明与奈福泮联合应用是通过两种不同的效应系统发挥作用的。新斯的明通过毒蕈碱受体作用于神经元细胞膜上与G蛋白耦联的受体，受体激活后可以增加神经元细胞膜对钾离子的通透性，通过神经元的超极化而抑制神经元活动［7］;而奈福泮的镇痛机制之一是可阻断突触前电压敏感钠通道减少Ca2+内流，使谷氨酸释放减少，导致NMDA受体神经元兴奋性的降低［8］。可能脊髓背角胆碱能受体与NMDA受体之间产生相互作用。因此，在本实验中，受体之间功能性相互作用可能增加，新斯的明和奈福泮联合用药产生的协同作用可能有赖于胆碱能受体NMDA受体的激活。尽管存在着上述假设，但其确切机制还有待于进一步研究。

联合镇痛的目的就是以最小剂量来获得最理想的镇痛效果，而副作用最小。我们在实验中鞘内联合应用奈福泮或/和新斯的明于术后疼痛大鼠观察到明显的镇痛效果，未出现明显不良反应，可以达到联合镇痛的目的。但在临床应用中能否达到预期的效果有待于做临床实验进行进一步的研究。

［1］ 潘道波，胡兴国，王远胜，等.鞘内注射新斯的明对切口疼痛大鼠脊髓兴奋性氨基酸含量的影响［J］.中华麻醉学杂志，2004，24(14):91－93.

［2］ Sunshlne A，Laska E.Nefopam and morphine in man［J］.Clin Pharmacol Ther，2005，18:530 －534.

［3］ 杨建平，蒋豪，吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的改进［J］.中华麻醉学杂志，1993，13(12):110 －112.

［4］ Brennan TJ，Vandenneulen EP，Gebhan GF.Characterization of a rat model of incisional pain［J］.Pain，1996，64:493 －501.

［5］ Tallarida RJ，Porreca F，CowanA.Statistical analysis of drug-drug and site-site interactions with isobolograms［J］.Life Sci，2003，45:947－961.

［6］ 徐端正.生物统计在试验和临床药理学中的应用［M］.北京:科学出版社，2004:8.

［7］ Yang LC，Chen LM，Wang CJ，et al.Postoperative analgesia by intra-articular neostigmine in patients undergoing knee arthroscopy［J］.Anesthesiology，2008，88(2):334 － 339.

［8］ Fernandez-Sanchez MT，Diaz-Trelles R，Groppetti A，et al.Nefopam，an analogue of orphenadrine，protects against both NMDA receptor-dependent and independent veratridine-induced neurotoxicity［J］.Amino Acids，2009，23(1 －3):31 －36.

Effects of intrathecal nefopam and neostigmine on incision pain in rats

GUO Yun-he，LI Xiang，BO Wu-hai，WANG Yan-hong(Dept of Surgery，Medical College of Shanxi Datong University，Datong 037009，China)

ObjectiveTo explore the effect of intrathecal nefopam and neostigmine on postoperative pain in rats.MethodsAfter intrathecal implantation，the incision pain rat models were established and used to evaluate the pain behaviors by cumulative pain scores.The dose-response curve and the 50%effective dose(ED50)were obtained after intrathecal injection of neostigmine and nefopam using sequential methods.The ED50of neostigmine and nefopam were calculated for observing the drug interactions when different fractions of ED50of both neostigmine and nefopam were administered together.Results①The ED50of intrathecal nefopam(50 －150 μg)alone was 82.64 μg and 95%confidence intervals(CI)were 72.53 － 94.14 μg.The ED50of intrathecal neostigmine(1 － 10 μg)alone was 8.36 μg and 95%confidence intervals were 6.68 － 10.70 μg.When the two drugs were used together at the doses of 1/2ED50，1/4ED50，1/8ED50and 1/16ED50，the ED50of nefopam was 10.93 μg(95%CI 6.83 －17.49 μg)，and the ED50of neostigmine was 1.05 μg(95%CI 0.66 －1.68 μg).②Intrathecal administration of nefopam，neostigmine or their combination produced a significant dose-dependent analgesic effect in incision pain rats.③According to the Isobologram methods by Tallarida，it was deduced that nefopam and neostigmine had the synergistic analgesic interaction.Conclusion①Nefopam at the dose of 50－150 μg and neostigmine at the dose of 1 －10 μg，both can produce a dose-dependant analgesic effect.②The analgesic effect of neotigmine and nefopam was synergistic.

nefopam;neotigmine;sequential method;intrathal injection;incision pain;rats

R969.2

A

1007 －6611(2011)02 －0112 －05

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.02.004

郭云翮，女，1977－03生，硕士，助教，E-mail:syh2959@sina.com.

2010－09－06］