张晓梅，杨云生，郭明洲

中国人民解放军总医院消化科，北京 100853

人Dact2基因真核表达载体的构建及其在结肠癌细胞中的表达

张晓梅，杨云生，郭明洲

中国人民解放军总医院消化科，北京 100853

目的构建人Dact2基因真核表达载体。方法以人胎肝cDNA文库为模板，利用RT-PCR方法获得Dact2编码序列，构建并鉴定表达Dact2的pCMV6-Entry-GFP真核表达载体。Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞株HT29，荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析转染效率，Western blot检测Dact2蛋白表达。结果通过PCR扩增获得了2 322 bp的Dact2编码序列，通过酶切及测序证实Dact2序列正确插入真核表达载体pCMV6-Entry-GFP;转染空载体和Dact2表达质粒48 h后，荧光显微镜下观察，可见两组细胞均表达绿色荧光蛋白，流式细胞仪分析结果显示瞬时转染效率分别为41.36% 和39.88%。Western blot检测证实转染表达质粒组的细胞Dact2蛋白呈阳性表达。结论成功构建了人Dact2真核表达载体，为其功能研究奠定了基础。

Dact2;载体;表达

Dact(Homo sapiens dapper，antagonist of beta-catenin)又名dapper、frodo，是近年来发现的新发育相关的基因家族［1-4］。该家族包括3个成员:Dact1、Dact2和Dact3，分别定位于染色体14q22、6q27和19q13。研究表明Dact1和Dact3分别在肝癌和结肠癌中发挥重要作用［5-6］，但是Dact2在肿瘤发生中的作用尚不清楚。本研究拟构建人Dact2基因的真核表达载体，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:Sgf1、Mlu1限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNaseⅠ均购自TakaRa公司;TOP10F菌株购自Clontech公司;引物合成、测序均由Invitrogen公司完成。pCMV6-Entry-GFP质粒是本实验室在pCMV6-Entry质粒基础上融合GFP标签蛋白后改建而成，该质粒全长 4.9 kb，包含 CMV启动子、多克隆位点(MCS)、卡那霉素抗性基因及 GFP基因。人胎肝cDNA文库由第四军医大学唐都医院口腔科馈赠;兔来源的Dact2多克隆抗体购自Prosci公司。……