武敏，马文丽

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

角倍蚜总RNA提取方法的比较及优化

武敏，马文丽*

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

采用Trizol法及试剂盒柱提法提取角倍蚜若虫及成虫总RNA，通过紫外分光光度法（OD260／OD280、OD260／OD230）及琼脂糖凝胶电泳检测，对所提取RNA的纯度、浓度及完整性进行了分析.结果表明，采用常规样品量两种方法提取的RNA均降解严重，分析认为角倍蚜富含内源性RNase.通过大幅降低样品量，优化提取步骤，缩短提取时间，有效消除了RNA降解现象.采用Trizol法获得了纯度高、完整性好的RNA样品，电泳显示清晰的28S、18S及5S三条带；试剂盒柱提法获得的RNA呈现较为特殊的带型，没有常规的5S条带，而在750 bp～1 000 bp之间有一明显条带.

角倍蚜；RNA提取；Trizol法；试剂盒柱提法

五倍子蚜属同翅目蚜总科瘿棉蚜科，指寄生在漆树科盐肤木属植物上形成五倍子虫瘿的一类蚜虫［1］.角倍蚜（Schlechtendalia chinensis）是五倍子蚜中分布最广的一种，其寄生于盐肤木上所形成的角倍产量占五倍子总产量的75%，具有较高的经济价值［2-3］.

提取高质量的RNA是基因克隆、cDNA文库构建和基因表达分析等分子生物学研究的最基础工作［4］.提取RNA的方法很多，常用的有Trizol法、异硫氰酸胍法、CTAB法［5-6］.但由于不同样品化学成分的差异，实际操作中还需依据研究材料的自身特点，对多种方法进行比较优化，找出最适方法，建立最佳体系，才能获得高质量RNA.目前虽然已从多种动植物材料中提取到了高质量的RNA，但对于蚜虫这一小型昆虫，这方面的研究十分有限［7-8］.本研究采用商品化的Trizol法及试剂盒柱提法提取角倍蚜若虫及成虫总RNA，经过样品量及提取步骤的优化改进，建立了一个高效、稳定的Trizol法提取角倍蚜总RNA体系，获得了高质量的角倍蚜若虫及成虫总RNA，为进一步的分子生物学研究奠定基础.

1 材料和方法

1.1 蚜虫材料

角倍蚜由湖北省五峰五倍子基地提供.分别于2010年8月底及9月底，采集盐肤木上寄生的角倍，于当天空运至上海.角倍内的蚜虫可存活一周左右，分别为角倍蚜若虫及有翅成虫.实验时用毛笔小心扫取蚜虫于Ep管内，称量后进行RNA提取.

1.2 试剂及仪器

Trizol试剂购自Ta KaRa公司；RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒、Quant cDNA第一链合成试剂盒、RNase-free的Ep管、Tip头购自天根公司；三氯甲烷、异丙醇、乙醇等其他试剂均为RNA实验专用.实验所用的玻璃、金属制品均在180℃下烘4 h以上.其他仪器设备和试剂均保证干净且无RNAase污染；引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3 RNA的提取

1.3.1 Trizol试剂法

分别称取角倍蚜若虫及成虫100 mg，置于液氮预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末；加入1 m L的RNAiso Reagent，室温静置至完全融化，继续研磨至裂解液呈透明状，将匀浆液移至离心管中，室温静置5 min，12 000 g 4℃离心5 min，小心吸取上清液，移入新的离心管.用移液枪反复吹吸至裂解液中无明显沉淀，室温静置5 min，加入氯仿0.2 m L，盖紧离心管盖，用力震荡，待充分乳化溶液呈乳白状后，室温静置5 min，12 000 g 4℃离心15 min；此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，静置10 min.12 000 g 4℃离心10 min，小心弃去上清，缓慢沿离心管壁加入75%的乙醇1 m L（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12 000 g 4℃离心5 min后小心弃去乙醇，室温干燥沉淀2～5 min，加入50μL的RNasefree水溶解沉淀，取3μL电泳检测，于-80℃保存.

1.3.2 柱式RNA试剂盒法

分别称取角倍蚜若虫及成虫50 mg，在液氮中迅速研磨成粉末，加入300μL裂解液RL（主要成分为异硫氰酸胍，含1%的β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀；加入590μL RNase-free dd H2O和10μL蛋白酶K，混匀后56℃处理10 min，13 400 g离心5 min，小心吸取上清至RNase-free的离心管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR中，13 400 g离心30～60 s，用350μL去蛋白液洗涤2次去除蛋白质污染，用DNase液洗涤1次去除DNA污染，用漂洗液（70%乙醇）洗涤2次去除盐及小分子污染，晾干吸附柱，放入新的RNase-free的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50μL RNase-free dd H2O，13 400 g离心2 min，得到RNA溶液，取3μL电泳检测，于-80℃保存.

1.3.3 总RNA的质量检测

每种方法提取的RNA取3μL，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性.RNA样品取1μL在NanoDrop 2000超微量分光光度计上检测，直接获得OD280／A260和OD260／A230的数值.

1.3.4 cDNA第一链的合成

使用天根公司的Quant cDNA第一链合成试剂盒，具体操作按产品说明书进行.

1.3.5 引物设计和 RT-PCR扩增

根据GenBank登录的角倍蚜看家基因18S rRNA基因序列（AF195507）设计引物：18Sf：5′GCTAATACATGCCGACAGAG 3′，18Sr：5′CGA CAGTT GATAAG GCA G AC3′.PCR反应体系：cDNA 模板1μL，引物（20 μmol／L）各1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，MgCl2（25 mmol／L）1.5μL，Taq酶0.25μL，加灭菌超纯水至25μL，混匀离心后扩增.扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；48℃复性30 s；72℃延伸30 s，30个循环；然后72℃延伸5 min.PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，送至上海生工公司测序.

2 结果与分析

2.1 角倍蚜总RNA的提取

如图1、2（P106）所示，以角倍蚜若虫和成虫为材料，用Trizol法及试剂盒柱提法提取总RNA，2种方法分别采用常规样品量100 mg及50 mg，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现2种方法得到的总RNA均降解严重；经降低样品质量，分别取50 mg及30 mg，并优化提取流程，缩短提取时间，经Trizol法获得带型清晰的总RNA，28S r RNA和18S r RNA的条带比例合适，没有降解，基本没有DNA污染.而试剂盒柱提法获得的总RNA呈现的带型较为特殊，没有典型的5S条带，而在750bp～1000 bp之间有一明显条带，经多次实验均为此结果，推断可能为试剂盒中某些物质使28S降解所致.经比较我们认为Trizol法经优化取样量及提取流程，更适于蚜虫总RNA的提取.而适用于常规动物组织的试剂盒柱提法，使蚜虫总RNA发生了特异降解，不适于蚜虫总RNA的提取.

2.2 紫外分光光度法检测总RNA浓度

图3（P106）为Trizol法提取到的角倍蚜若虫、成虫总RNA经NanoDrop 2000超微量分光光度计获得的紫外扫描图谱，结果显示，OD260／OD280均在1.8～2.0之间，说明提取的RNA纯度较高，没有蛋白质污染；OD260／OD230均接近于2.0，满足进一步实验要求；RNA得率较高，若虫及成虫均达到100μg／g以上.

图1 Trizol法提取角倍蚜总RNA电泳图1若虫（优化前） 2成虫 （优化前）3若虫（优化后） 4成虫（优化后）Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA of Schlechtendalia chinensis extracted by Trizol Reagent 1 larva（before optimization），2 adult（before optimization），3 larva（after optimization），4 adult（after optimization）

图2 试剂盒柱提法提取角倍蚜总RNA电泳图1若虫（优化前） 2成虫 （优化前）3，4若虫（优化后） 5，6成虫（优化后）Fig.2 Agarose electrophoresis of total RNA of Schlechtendalia chinensis extracted by RNAprep pure kit 1 larva（before optimization），2 adult（before optimization），3，4 larva（after optimization），5，6 adult（after optimization）

图3 角倍蚜若虫及成虫总RNA紫外吸收光谱Fig.3 Ultraviolet Absorption spectrometry of total RNA of Schlechtendalia chinensis

2.3 RT-PCR扩增

RT-PCR扩增结果如图4（P107）所示，以Trizol法提取的角倍蚜若虫及成虫总RNA为模板，分别扩增出与预期长度225bp相符合的cDNA片段，测序结果证实是角倍蚜18Sr RNA片段.在此基础上，以角倍蚜第一链cDNA为模板，用随机引物进行角倍蚜双链cDNA的合成.从扩增结果（图5，P107）可以看出，扩增得到的双链cDNA片段大小主要分布在0.2～2.0 kb之间，表明提取的总RNA质量较好，基本无降解.

3 讨论

蚜虫个体较小，RNA含量较少，提取困难，目前市场上没有针对蚜虫而开发的RNA提取试剂［7］.Trizol试剂是目前应用最广泛的、商品化生产的RNA提取试剂，是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液，酚使蛋白变性，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶，防止RNA的降解.Trizol试剂适用范围广，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA，其最适合的对象是动物源性的组织［9-10］.采用Trizol试剂提取角倍蚜总RNA的过程中，开始获得的RNA严重降解，经分析后认为，角倍蚜作为小型昆虫，其内源性RNA酶含量高于普通动物组织如肌肉等，应参照动物肝脏、脾脏等总RNA提取方法，加大Trizol试剂用量，我们将100 mg样品量调整为50 mg，同样用1m LTrizol试剂裂解，为防止提取的RNA浓度过低，改用30μL RNase-free dd H2O溶解.另外，尽量在低温下操作，使用冷冻离心机；液氮研磨和加入裂解液以及氯仿抽提等步骤都小心细致，尽量缩短时间，避免RNA降解.经过一系列调整，用Trizol试剂提取获得了纯度较高的角倍蚜幼虫及成虫总RNA.

图4 RT-PCR扩增角倍蚜18S rRNA片段Fig.4 Amplification of 18S RNA gene fragment by RT-PCR

图5 角倍蚜双链cDNA扩增结果Fig.5 Amplification of double-strand cDNA by random primers

试剂盒柱提法原理为裂解液／β-巯基乙醇迅速裂解细胞，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱.该方法优点为不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，缺点为价格较贵，产量较低.我们用于蚜虫总RNA提取时，获得的总RNA呈现的带型较为特殊，没有常规的5S条带，而在750 bp～1 000 bp之间有一明显条带，经多次实验均为此结果，推断可能为试剂盒中某些物质使28S r RNA降解所致，有待于进一步研究.

［1］ 张广学.中国动物志.第十四卷，昆虫纲：同翅目［M］.北京：科学出版社，1999.

［2］ 张传溪，徐厚樑，唐觉.温度对角倍蚜越冬世代多型现象的影响［J］.昆虫学报，1993，6（4）：497-499.

［3］ 杨子祥，吕翔，杨红燕，等.不同保存方法对角倍蚜性蚜数量和存活率的影响［J］.林业科学研究，2011，24（1）：63-67.

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Comparison and Improvement of Methods for Extracting Total RNA fromMalaphischinensis

WU Min，MA Wen-li
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

In order to extract high quality RNA fromSchlechtendaliachinensis，Trizol method and RNAprep pure kit method were compared.The quality of the total RNA was detected and analyzed by ordinary agarose gel electrophoresis，UV spectrophotometer（OD260／OD280、OD260／OD230）and RT-PCR.The results showed that the total RNA obtained by two methods with ordinary amount of sample both degraded severely.By reducing the amount of sample and shortening the extraction time，pure and integrate RNA were isolated by improved Trizol method from larva and adult.RT-PCR analysis domenstrated that the isolated RNA can be used for the following-up molecular biology operations.

RNA extraction；Schlechtendaliachinensis；Trizol method；RNAprep pure kit method

Q966

A

0253-2395（2011）S2-0104-04

2011-09-20

中国博士后科学基金（20100470637）

武敏（1986-），女，山西太原人，硕士研究生，主要研究蚜虫与寄主植物的相互作用.E-mail：chinasx35＠163.com.*通讯作者：E-mail：mawl＠sxu.edu.cn