刘逸寒，路福平，王建玲，胡 博

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

刘逸寒，路福平，王建玲，胡 博

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

利用高效表达载体pWB980，实现了Bacillus subtilis BF7658中温α–淀粉酶基因amy在B. subtilis DB403中的高效表达，活力达到770,U/mL.经多步纯化，重组酶AMY的比活达到35.8,U/mg，纯化倍数为1.7，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经 SDS-PAGE检测，重组酶 AMY相对分子质量为 4.8×104.对酶学性质进行分析，重组酶 AMY的最适反应温度为60,℃，最适反应pH为6.0.

枯草芽孢杆菌；中温α–淀粉酶；高效表达；纯化；酶学性质

中温α–淀粉酶的最适作用温度和 pH分别为60,℃和 6.0，是工业中应用最普遍的酶种之一，被广泛应用于淀粉糖、味精、啤酒、酒精以及纺织退浆等工业生产[1].1965年，我国开始应用B. subtilis BF7658生产α–淀粉酶，发酵活力为 200,U/mL左右[2].我国于 20世纪 90年代后期引进了国外生产中温α–淀粉酶的优良菌株B. amyloliquefaciens和工艺技术，发酵活力平均在 400,U/mL左右.目前我国多数厂家仍采用 B. subtilis BF7658及其变异株生产中温α–淀粉酶，产酶水平稳定在 550,U/mL左右.但与其他酶制剂品种相比较，其发酵水平提高较慢，限制了中温α–淀粉酶在各行业中的应用.

目前，枯草芽孢杆菌表达系统已成为继大肠杆菌之后重要的原核表达系统.枯草芽孢杆菌遗传背景清楚[3]，蛋白分泌机制健全，生长迅速，培养简便，不分泌内毒素，具有较好的生物安全性，是美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部批准使用的安全菌株；并且它可直接将表达产物分泌到培养基中，产物便于提取和纯化，是表达外源基因的良好受体菌.但由于枯草芽孢杆菌自身可向胞外分泌高浓度的蛋白酶，以致影响了表达产物的产量和稳定性.

本研究将获得的B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶基因，利用表达载体pWB980[4]和宿主菌株B. subtilis DB403[5]，对中温α–淀粉酶进行表达.表达载体pWB980具有高拷贝数(121个/细胞)且含有可高效表达外源基因的 P43启动子以及可将外源蛋白分泌到细胞外的信号肽 sacB基因；同时，B. subtilis DB403为 3个蛋白酶缺陷菌株，可减少胞外蛋白酶的分泌量，以期获得中温α–淀粉酶的高效表达，为以淀粉为原料深加工工业的发展提供有力的支撑.

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与培养基

B. subtilisBF7658和B. subtilisDB403，均为本实验室保存.质粒 pWB980由加拿大 Calgary大学Dr. Sui-Lam Wong惠赠.

LB培养基用于细菌培养，筛选培养基为含卡那霉素 30,μg/mL的 LB/琼脂培养基，酶活力初步检测培养基为含 1%淀粉的 LB/琼脂培养基，用作透明圈选择.枯草芽孢杆菌转化培养基为 GMI、GMII培养基[6].

1.2 酶与试剂

基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、高保真 TaqDNA 聚合酶，TaKaRa公司；DNA相对分子质量标准、蛋白相对分子质量标准、卡那霉素，上海英骏生物技术有限公司；引物合成及测序由TaKaRa 公司完成.

1.3 重组菌株的构建

根据 NCBI网站公布的 B. subtilisα–淀粉酶基因序列，经比对后设计引物，以B. subtilisBF7658总 DNA为模板，PCR扩增获得B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶基因 amy，上游引物 P1：5′-CCC AAGCTTTTGCGCTTACAGCACCGTCGATCAA-3′(下划线部分为 HindIII酶切位点)，下游引物 P2：5′-CGCGGATCCTTGAAAGAATGTGTTACACCT-3′(下划线部分为BamHI酶切位点).将PCR产物及提取的质粒pWB980，分别用HindIII和BamHI进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4 DNA连接酶于16,℃连接过夜，构建重组质粒 pWB-amy，参照文献[7]转化B.subtilisDB403，将含卡那霉素的酶活初步检测平板上的转化子逐一点接在含卡那霉素的 LB/琼脂平板上保存，碘液熏蒸检测平板，确定透明圈与菌落直径比值大的转化子后，在 LB/琼脂保存平板上挑取相应转化子，分别进行 PCR和双酶切法鉴定并进行测序.

1.4 重组酶的表达

将获得的工程菌株 pWB-amy/DB403和对照菌株 pWB980/DB403分别接种于 5,mL的含卡那霉素LB培养基中，37,℃振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有50,mL含卡那霉素LB培养基的250,mL三角瓶中，37,℃培养 36,h，12,000,r/min 离心 10,min，收集上清液，SDS-PAGE(分离胶浓度为 10%，浓缩胶浓度为 5%)检测蛋白的表达情况，同时测定酶活力.采用Lowry法测定蛋白含量[8].

1.5 工程菌株7,L发酵罐放大培养

种子培养基：LB培养基.

发酵培养基(g/L)：玉米粉 55，豆饼粉 45，淀粉2，硫酸铵 4，磷酸氢二钠 8，氯化铵 1.3，氯化钙 2.7，pH自然.

7 L发酵罐培养条件参照文献[9].

1.6 活力检测

中温α–淀粉酶活性测定方法和其他溶液的配制参照 QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》.酶活计算：X＝c×n.式中：X为样品的酶活力，U/mL(U/g)；c为测试酶的浓度，U/mL；n为样品的稀释倍数.

1.7 重组酶的分离纯化

收集工程菌 pWB-amy/DB403发酵上清液100,mL，加硫酸铵至 70%，4,℃静置过夜，6,000,r/min离心20,min，蛋白沉淀用10,mL 0.02,mol/L磷酸缓冲液(pH,7.0)溶解.得到的活性组分上样到用浓度为0.02,mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡过的 DEAESepharose Fast Flow(2.4,cm×30,cm)离子交换层析柱，用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1,mol/L,NaCl的 0.02,mol/L磷酸缓冲液(pH,7.0)线性梯度洗脱，收集活性组分.将得到的活性组分上样到用 0.02,mol/L磷酸缓冲液(pH,7.0)平衡过的Sephadex G-75(1.6,cm×80,cm)凝胶层析柱，再用同样的缓冲液洗脱，收集活性组分.每步收集到的活性组分进行活力检测，并采用 Lowry法测定蛋白含量[8].

1.8 重组酶学性质分析

1.8.1 温度对酶活力的影响

纯酶最适反应温度的测定：在不同温度(30、40、50、60、70、80、90、100,℃)、pH 6.0 条件下保温5,min，测定重组酶纯酶液的酶活力，将最高酶活力定为100%.

纯酶的热稳定性测定：将重组酶纯酶液置于不同温度(40、60、80、100,℃)、pH,6.0 条件下保温 1,h，每隔10,min取出，各自测定其残余酶活力，以未保温的酶液活力为100%，绘制热稳定性曲线.

1.8.2 pH对酶活力的影响

纯酶最适反应 pH 的测定：在不同 pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、60,℃条件下保温 5,min，测定重组酶纯酶液的酶活力，将最高酶活力定为100%.

纯酶的 pH稳定性测定：将重组酶纯酶液在不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)条件下 60,℃保温 60,min，各自测定其残余酶活力，将最高残余酶活力定为100%，绘制pH稳定性曲线.

2 结果与分析

2.1 重组菌的筛选与鉴定

以提取的B. subtilisBF7658总DNA为模板，利用 PCR扩增出中温α–淀粉酶基因片段(GenBank 的登录号为 FJ463162).测序结果表明中温α–淀粉酶的信号肽含有 41个氨基酸，成熟肽含有 436个氨基酸.将中温α–淀粉酶成熟肽基因片段amy经HindIIIBamHI双酶切，与HindIII-BamHI线性化的质粒pWB980连接，构建重组质粒pWB-amy.将构建的重组质粒pWB-amy转化B. subtilisDB403，通过水解透明圈与菌落直径比筛选活力高的重组菌株，在含有卡那霉素的 LB/琼脂平板上挑取该阳性转化子，提取质粒分别用HindIII和HindIII-BamHI进行单酶切和双酶切验证，电泳检测结果(图 1)表明重组子质粒中已带有目的基因amy，获得重组菌株pWB-amy/DB403.

图1 pWB-amy重组质粒酶切图Fig.1 Verification of recombinant plasmids with single and double enzyme digestion

2.2 重组酶AMY的表达

将pWB-amy/DB403、B. subtilisBF7658和pWB980/DB403分别点接到含 1%淀粉的 LB/琼脂平板上，如图 2所示.pWB-amy/DB403的水解透明圈与菌落直径的比值明显大于B. subtilisBF7658和pWB980/DB403.

将pWB-amy/DB403和pWB980/DB403在37,℃分别培养 36,h，收集上清液，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况(图 3)，pWB-amy/DB403的上清液中发现有相对分子质量为 4.8×104的表达蛋白 AMY(泳道1)，与经过纯化的B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶(泳道 4)的大小一致，在 pWB980/DB403(泳道 3)上清液中未发现同样的表达产物.同时，测定 pWB–amy/DB403上清液中温α–淀粉酶 AMY的酶活力可达530,U/mL，而B. subtilisBF7658的中温α–淀粉酶活力仅为 200,U/mL.按照方法 1.5所述对 pWB–amy/DB403进行 7,L发酵罐放大培养，中温α–淀粉酶AMY的酶活力可达770,U/mL.

图2 α–淀粉酶活性的平板检测Fig.2 Plate assay for activities of alpha amylase

图3 表达产物的聚丙烯凝胶电泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of proteins secreted by B. subtilis DB403

2.3 重组酶的分离纯化

收集 pWB-amy/DB403发酵上清液 100,mL，经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow(2.4,cm×30,cm)离子交换层析、Sephadex G-75(1.6,cm×80,cm)凝胶层析，进行纯化.通过对重组酶 AMY 整个提纯工艺各纯化步骤的总蛋白、总酶活、比活、纯度及回收率等指标的跟踪测定，得到 100,mL重组酶发酵上清液的纯化表，见表 1.重组酶 AMY发酵上清液经分离纯化后，纯度提高了 1.7倍，回收率为74.3%.重组酶AMY的粗酶液经纯化后，得到相对分子质量为 4.8×104的单一电泳条带(图 3，泳道 2)，与经过纯化的B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶(图3，泳道4)的大小一致.

表1 重组酶AMY纯化表Tab.1 Summary of purification of recombinant AMY

2.4 重组酶的酶学性质分析

2.4.1 酶的热稳定性

重组酶AMY及B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶反应的最适温度均为 60,℃.分别对 AMY及B.subtilisBF7658中温α–淀粉酶的热稳定性进行分析，结果表明在 40,～80,℃保温 60,min，残余酶活分别为初始活力的90%、80%及50%(图4和图5)；在100,℃保温30,min，完全失活.

图4 重组酶AMY的热稳定性曲线Fig.4 Thermostability curve of recombinant AMY

图5 B. subtilis BF7658中温α -淀粉酶热稳定性曲线Fig.5 Thermostability curve of the medium-temperature alpha amylase in B. subtilis BF7658

2.4.2 酶的pH稳定性

重组酶AMY及B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶的最适 pH为 6.0.分别对 AMY及B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶的pH稳定性进行分析(如图6所示)，结果表明在60,℃保温60,min，pH在5.5～7.5范围内较稳定.

图6 B. subtilis BF7658中温α-淀粉酶及AMY的pH稳定性曲线Fig.6 Stability curve of pH of recombinant AMY and the medium temperature alpha amylase in B. subtilis BF7658

3 讨 论

本项研究中，利用高效表达载体 pWB980，以 3个蛋白酶缺陷的B. subtilisDB403作为宿主菌株，实现了B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶的高效表达，经发酵工艺优化后，活力可达到770,U/mL，明显高于出发菌株B. subtilisBF7658的中温α–淀粉酶活力200,U/mL.董晨等[10]利用强启动子 P43实现了地衣芽孢杆菌耐高温α–淀粉酶在B. subtilis1A752S中的高水平表达，比原始菌株提高了 8.9倍.刘逸寒等[11]利用质粒 pWB980与 6个蛋白酶缺陷的 B. subtilis WB600实现了突变耐酸性高温α–淀粉酶的高效表达，活力可达到 4,700,U/mL.可见，由强启动子高拷贝载体质粒及本身胞外蛋白酶减少的枯草芽孢杆菌宿主菌株构建的表达体系可有效提高产酶量.

重组酶 AMY经超滤、硫酸铵盐析、离子交换层析及凝胶层析纯化后，得到的 AMY比活为35.8,U/mg，纯化倍数为 1.7倍，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品.在纯化过程中，操作相对简单且每步回收率较高，分析原因为外源蛋白表达量较高，同时由于宿主菌株B. subtilis DB403胞外蛋白分泌相对较少，稳定了外源蛋白并简化了纯化过程.

重组酶AMY与B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶最适温度均为 60,℃，在 40～80,℃保温 60,min，残余酶活分别为初始活力的 90%、80%及 50%；在100,℃保温 30,min，完全失活.AMY 及B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶的最适 pH 为 6.0.分别对AMY及B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶的pH稳定性进行分析，结果表明在 60,℃保温 60,min，pH 在5.5～7.5范围内较稳定.研究显示，中温α–淀粉酶经过不同的宿主菌株表达后，催化性质并没有发生改变，保留原有的生物学活性.

外源基因的表达多采用大肠杆菌细胞内表达，提纯蛋白需要将细胞破碎或裂解，过程繁琐.而枯草芽孢杆菌具有将胞内蛋白分泌到细胞外的特点引起人们的普遍关注，利用枯草杆菌的分泌特点，构建高效表达体系表达外源蛋白，可简化生产工序，有效降低生产成本.在本研究基础上，下一步探索将B. subtilisBF7658中温α–淀粉酶分别实现在分泌胞外蛋白酶更少的B. subtilisWB600中的游离及整合型表达，利用高拷贝质粒或将目的基因构建多个拷贝整合入宿主菌株基因组中，获得安全高效稳定的表达，为进一步工业化大规模生产应用在不同行业中的中温α–淀粉酶奠定坚实的基础.

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High-Level Expression of the Medium-Temperature Alpha Amylase inBacillus subtilis

LIU Yi-han，LU Fu-ping，WANG Jian-ling，HU Bo
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The medium-temperature alpha amylase gene fromBacillus subtilisBF768 was cloned into vector pWB980 and high-level expressed inB. subtilisDB403. The activity of AMY in the supernatant of the culture medium reached a maximum of 770 U/mL. By multi-step purification，the specific activity of AMY was up to 35.8 U/mg with a 1.7-fold purification. The recombinant enzyme AMY had a molecular mass of 4.8×104. The optimum pH and temperature of AMY was 6.0 and 60 ℃.

Bacillus subtilis；medium-temperature alpha amylase；high-level expression；purification；enzyme properties

Q814.4

A

1672-6510(2011)04-0001-05

2011–03–23；

2011–05–27

天津市科技攻关重点培育项目(06YFGPSH03500)；天津科技大学自然科学基金资助项目(20090205)

刘逸寒（1982—），男，天津人，讲师，博士，lyh@tust.edu.cn.