姜恒,许建中,侯天勇

(1.成都医学院检验医学院输血教研室,四川 成都 610083;2.第三军医大学西南医院骨科,重庆 400038)

临床上用抗生素治疗慢性骨髓炎时由于骨感染后局部失血管化和/或生物被膜的形成,致使药物在体内病灶扩散和渗透发生障碍,全身用药即使达到毒性剂量也不能确保足够的局部有效治疗浓度,因此寻找有效治疗途径对治疗慢性骨髓炎非常关键。从全身用药到局部使用庆大霉素骨水泥链珠,直至最近生物可降解、合成可降解的药物缓释技术,让我们看到治疗慢性骨髓炎新的希望。

在各种缓释材料系统中,天然聚合物材料由于其价格低廉、来源广泛、安全无毒并利于环保,对其开发利用也更富有吸引力,其中海藻酸钠、壳聚糖等多糖类材料因具有极好的生物相容性和生物可降解性,有条件成为良好的给药载体而得到广泛的研究[1-4]。海藻酸是存在于褐藻类中的一类天然多糖,是β-D-甘露糖醛酸(简称M)和α-L-古洛糖醛酸(简称G)通过(1-4)糖苷键连接形成的一类线形无分枝的链状阴离子聚合物,其结构特点为 G型结构如扣带弯曲而M型结构呈带状伸展,所以 G型结构与盐离子结合易形成凝胶,而M型结构与盐离子结合易形成溶胶[5-10]。

海藻酸盐种类繁多,其结构不同可影响理化和生物学特性[11-17]。海藻酸钠的相对分子质量对缓释作用的影响较大,其相对分子质量与释药速度之间有良好的线性关系,海藻酸钠的相对分子质量越大,黏度越大,释药速度越慢。海藻酸钠作为缓释制剂的载体,M/G值影响缓释作用。Akihiko等研究相对分子质量较小模型药物的结果显示,M/G值越大,释放速度越快。

因此,本研究利用海藻酸钠不同类型的特殊理化性质,根据Hou T前期试验工作结果,对藻酸盐万古霉素微球进行优化。实验中选取了高 G型、分子量较大、粘滞度较高的藻酸盐包裹万古霉素与氯化钙交联形成复合微球,并考察其相关指标的优化情况,从中筛选出较理想的品种,以便深入进行下一步实验工作。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

藻酸盐(Sigma):A2158为低粘度、低 G型, A0682为低粘度、低G型,A2033为高粘度、低 G型(代号 H型),A71238为低粘度、高 G型(代号 G型)。万古霉素:标准品V2002(Sigma),实验用品为稳可信(注射用盐酸万古霉素,Eli Lilly Japan K. K.)。氯化钙:分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 主要仪器和设备

台式离心机(Sigma);BP211D型电子天平(德国Sartorius公司);420A+PH计(美国 ThermoO-rion公司);D400型立式电热蒸汽消毒器(上海翔运医用设备厂);79-1型磁力热搅机(江阴科研器械厂);高效液相色谱仪(Waters 510泵,484紫外检测器);冷冻干燥机(Savant Modulyo);游标卡尺(TESA 0.02 mm,陕西威尔机电科技有限公司)。

1.3 方法

分别称取上述各类一定质量的藻酸盐溶解于去离子水中,分别配制成2%、4%、8%、10%、12%和16%溶液,分别与等体积的50 mg/mL和30 mg/ mL的万古霉素溶液混合,搅拌10 min后,形成均一粘稠的溶液,用注射器抽取后,装上直径1.2 mm的注射器针头,加压后使藻酸盐万古霉素混合溶液缓慢滴入到搅动的1.01%氯化钙水溶液中。10 min后,将从氯化钙水溶液中收集的藻酸盐微球用去离子水洗净后,-70℃冻存6 h后再低压冻干6～8 h直至重量不再变化,分装保存。Sartorius天平(精度0.1 mg)称取大致相同质量的由不同浓度藻酸盐和万古霉素溶液制备的微球,加入到5 mL的5%柠檬酸三钠溶液中,放置在37℃的100 rpm摇床上裂解微球1 h。收集裂解液以 10 000 rpm离心10 min,取上清液在高效液相色谱仪上测定万古霉素浓度。万古霉素含量(%)=微球中万古霉素质量/藻酸盐微球的质量×100%。计算包封率:α=MV/ MA+MV,M理=M样＊α,EE=M实/M理(其中MV为制作微球时万古霉素总量,MA包被材料总量,M样是抽样检测微球总量,M理是抽样检测微球所含万古霉素理论值,M实为抽样检测微球裂解后的离心上清液通过高效液相色谱仪所测得万古霉素实际含量)。再将G、H型按质量比例1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1分别配制成不同浓度溶液,重复上述方法进行检测。同时对各组冻干微球用游标卡尺进行粒径粗略测定。

2 结果

由表1可见,通过初筛,高 G高粘度的海藻酸钠随着浓度增加可明显提高包封率。

表1 不同种类、不同浓度海藻酸钠包封率初步比较Tab.1 Comparison of encapsulation rates of multiple concentrations and kinds of alginate sodium

3 讨论

Hou T前期实验发现,用纤维蛋白凝胶包裹的藻酸盐微球缓释系统结合组织工程骨联合移植,可使局部组织获得长达21 d的有效抗菌时间,其远期的成骨情况良好,未见缓释系统对于成骨的不良影响。使用纤维蛋白凝胶藻酸盐包裹药物微球包封率有限(20.36±0.90%),制作万古霉素藻酸盐缓释微球颗粒较大(3 mm),投药量多,在动物体内试验中发现成骨延迟现象,表明微球颗粒占位影响成骨[18-19]。本研究就这两方面进行优化探讨,以便为进一步优化复合材料和动物体内骨组织工程实验做好准备。

研究发现:①不同种类不同浓度海藻酸钠包封率初步比较,高G、高粘度的海藻酸钠随着浓度增加可明显提高包封率。随着粘度、浓度增加,微球颗粒大小增加不明显;②由于条件限制,高粘度、高 G随浓度增加,梯度滴注制作微球会增加难度,甚至人力达不到(＜16%就很难产出球)。因此需要将高粘度、高G材料配比优化,也可降低浓度制作微球,抑或用机械化方法制作,使生产过程可靠、可控、可重复;③图1说明所测数据差别较大,总趋势显示G∶H(2∶1)包封率优化结果较好。数据差别较大的原因推测可能为微球颗粒大小差异造成,在图1结果的基础上固定每组颗粒数,并保证组内相近总质量的情况下达到较好一致性而得到图2,图2显示颗粒直径大小与各组微球包封率大小数值无关,数据差别仍然大。图1、2还显示A2158微球组稳定性较好,其他组号稳定性较差,说明存在微球不均匀性。

根据上述结果,需要改进的问题有:①药物在材料中的浓度不均一,今后在制作凝胶微球工艺方面有待进一步提高;②微球稳定性,文献报道微球在氯化钙溶液中孵育交联时间越长,微球稳定性能增强;③微球与壳聚糖复合后也能使微球更加稳定,但其复合时间是关键,需要试验摸索;④制作工艺中,药物与材料混合过程中产生的气泡是不可忽视的影响因素,需要对其抽气处理。

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