门晶，接晶，高学军，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

靶向奶牛Lepr基因的miR-30d报告基因载体构建及靶向验证

门晶，接晶，高学军，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

构建靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶报告基因载体，验证奶牛乳腺中瘦素受体基因（Lepr）是否为miR-30d的生物学靶基因。将microRNA荧光素酶表达报告载体特异性改造，使其含有TargetScan预测的与miR-30d靶向结合的奶牛Lepr基因序列，对miR-30d与重组荧光素酶载体质粒共转染后的细胞裂解液进行荧光素酶活性检测分析。结果表明，靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶表达报告载体构建成功，奶牛Lepr基因是miR-30d的靶基因，旨为miR-30d与Lepr基因的相互作用及与此基因相关的乳腺生物网络调控研究奠定实验基础。

Lepr；miR-30d；报告基因

0 引言

MicroRNA（miRNA）是一类参与基因转录后调控的内源性非编码小RNA[1，2]，其通过对靶mRNA的切割或翻译抑制来下调目的基因表达[3]。瘦素受体（LEPR）是一种跨膜受体，通过Lepr基因的信号转导影响着机体的多种生理过程[4，5]，并在哺乳动物乳腺发育、泌乳及退化过程中起着十分重要的作用[6-9]。本研究以荷斯坦奶牛乳腺Lepr这一泌乳相关重要功能调控基因与miR-30d靶向结合作用为切入点，通过构建miRNA荧光素酶报告基因载体对TargetScan中预测的miR-30 d的拟靶基因Lepr进行验证，旨在为奶牛乳腺发育与泌乳调控提供必要的研究手段和奠定重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

Trizol、Lipofectamine2000（Invitrogen），ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶SpeⅠ、HindⅢ、DNA分子量标准及T4-DNA连接酶（TaKaRa），质粒小量制备……