杨芳,张文红

(1.安康学院农学与生命科学院,陕西安康 725000;2.第四军医大学基因诊断技术应用研究所,陕西西安 710032)

随机肽库主要包括噬菌体展示随机肽库、大肠杆菌展示随机肽库和核糖体展示随机肽库三大类,它们在抗原表位分析、生物大分子相互作用位点分析、小分子肽疫苗设计及先导化合物的筛选等研究工作中已得到广泛应用。随机肽库淘筛一般会筛到大量的克隆,但要得到有意义的随机肽序列则必须进行大量的测序工作。使用常规DNA测序技术过程较为繁杂,费用也比较高。本研究基于焦磷酸微测序 (Pyrosequencing)技术,建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。

1 材料与方法

1.1 材料

环 7肽噬菌体展示随机肽库试剂盒 (Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit)购自美国 New England Biolabs公司,PSQ96序列分析系统、Pyrosequencing试剂盒 (SQA Reagent Kit)购自瑞典 Pyrosequencing AB公司。多肽区上游 PCR引物为 5′-attattattcgcaattcctttagt-3′,下游 PCR引物为 5′-ccacagacagccctcatagtt-3′(5′末端标记生物素);微测序引物为 5′-acctttctattctcactctgctt-3′。

1.2 方法

1.2.1 环 7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛 以链亲合素为筛选配基、生物素为洗脱液筛选链亲合素的结合肽基序。每一轮淘筛的肽库用量为 2×1011个噬菌粒,淘筛富集及扩增过程按照肽库试剂盒操作说明书进行,共淘筛 3轮。

1.2.2 微测序模板的制备 第 3轮淘筛的噬菌体洗脱液,滴度测定后从 LB/IPTG/X-gal板上随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机 7肽区序列:50μl反应体系中 10×PCR反应缓冲液5μl、25 mmol·L-1MgCl23μl、dNTPs的终浓度为125μmol·L-1、PCR引物的终浓度为 0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 2.5 U。PCR反应采用热启动,反应条件为:95℃预变性 5 min;然后 94℃变性 30 s,50℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共进行 45个循环;72℃延伸 5 min。随机选 5例 PCR扩增产物,取 5μl在 1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。……