何多姣,刘雪晴,李双霞,贾天军,张玉妥

(河北北方学院病原生物与免疫学研究所,河北张家口 075000)

不可分型流感嗜血杆菌 (nontypeableHaem ophilus influenzae,NTHi)是一种在人群中携带率很高的病原菌,该菌能够诱发炎症而产生多种疾病,如急性中耳炎、鼻窦炎、结膜炎和慢性支气管炎的反复发作及恶化[1]等,尤其是以其引起的急性中耳炎最为多见和严重,约 75%的儿童在 3岁之前至少患 1次中耳炎[2],NTHi一直是引起婴幼儿和儿童中耳炎的主要病原菌,约占所有报道中耳炎的 20%～40%;加之 NTHi缺乏快速准确的检测方法[3],而且其对以氨苄西林为首的β-内酰胺类等多种抗生素耐药性不断增强[4],使得临床治疗NTHi感染极为困难,因此目前亟待研究一种新型安全有效的疫苗来预防 NTHi的感染。研究证明在所有 Hi菌株 (含荚膜株及非荚膜株即 NTHi)中高度保守的外膜蛋白 P6(outermembrane protein P6,P6)可以诱导机体产生保护性的体液免疫和细胞免疫,但是 P6蛋白的获得极为繁琐且量少。近年来核酸免疫的发展为我们研制疫苗提供了新的思路,本研究就是通过克隆NTHi-P6基因,构建真核表达重组质粒 pcDNA3.1/His A-P6,为 NTHi核酸疫苗的研制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及细胞株

菌株 ATCC29247NTHi、感受态细菌 (E.coli,XL1-blue)、pcDNA3.1/His A质粒、HeLa细胞株均为本室保存。

1.2 主要试剂

限制性内切酶 B amHⅠ (50 U·μl-1)、N otⅠ(10 U·μl-1)、T4 DNA Ligase为 Takara公司产品;质粒大量提取试剂盒、脂质体、DNA Ladder DL10,000为碧云天公司产品;DNA Ladder DL22,000、Taq DNA聚合酶为凯基生物公司产品;FITC标记羊抗鼠 IgG单克隆抗体、质粒 mini提取试剂盒为 OMEGA B IO-TEK公司产品;鼠抗 NTHi-P6多克隆抗体为本实验室保存。

1.3 P6目的基因的获得

根据 GenBank提供的 86-028NP株……