于治国

（巢湖职业技术学院，安徽 巢湖 238000）

山茶花提取物预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用

于治国

（巢湖职业技术学院，安徽 巢湖 238000）

目的：探讨山茶花提取物（extract of Camellia japonica L,ECJ）预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法：采用大脑中动脉线栓法制作小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，观察ECJ预处理对小鼠大脑中动脉栓塞再灌注后脑梗死体积、血清小鼠神经特异性烯醇化酶（NSE）的活性及丙二醛（MDA）含量的变化。结果：与模型组对比，ECJ（15mg.kg-1，30mg.kg-1，60mg.kg-1）预处理明显减少脑梗塞体积，并可显著降低血清中NSE和MDA含量。结论：山茶花提取物预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。

山茶花提取物；脑缺血再灌注性损伤；药物预处理；小鼠

脑缺血再灌注损伤是急性脑血管病发生与发展中重要的病理生理基础。缺血预处理（Ischemic preconditioning，IP）最早是由Murry[1]等在犬心肌缺血模型中发现的，经典缺血预处理的概念是指短暂的缺血再灌注能使心肌在随后的长时程缺血再灌注中得到保护，减少心梗面积和缺血再灌注损伤，。Kitagawa等证实该现象同样存在于大脑，随后更多的实验证实了缺血耐受的器官的普遍性[2]。药物预处理（pharmacological preconditioning，PP）正是IP基础上提出来的。山茶花提取物（ECJ）是一种黄酮类物质，以往的研究发现ECJ对局灶性脑缺血再灌注性损伤具有良好的保护作用[3，4]。而山茶花提取物预处理（pharmacological precongtioning ofECJ）对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响机制未见明确的报道，因此，本研究就山茶花提取物预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响及其机制进行了研究。

1.材料

1.1 药品与试剂 ECJ：是用乙醇提取法提取山茶花中的有效成分，实验前用生理盐水配成所需浓度；尼莫地平注射液（nimodipine,Nim）山东方明股份有限公司出品；TTC（氯化三苯四唑啉 2，3，5-triphenyl tetrazaliumchloride,TTC），丙二醛（MDA），小鼠神经特异性烯醇化酶（NSE）测试盒均由南京建成生物研究所。

1.2 动物 昆明种小鼠，♀♂兼用，体重20-25g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：皖医实动准第02号。

2.方法

2.1 动物分组：70只昆明种小鼠随机分成7组，每组10只，♀♂各半。模型组（MODEL）：大脑中动脉（MCA）线栓阻断血流 60min，再灌注 24h；缺血预处理组（IP）：MCA线栓缺血5min后灌注5min，再缺血5min灌注30min，随后缺血60min,再灌注 24h；ECJ 三个不同剂量组（15，30，60mg.kg-1）：持续5min静脉推注不同剂量ECJ，停止给药5min，再次持续静脉给药5min，30min后阻断MCA血流60min,再灌注24h;尼莫地平组（2 mg.kg-1）：给药及实验程序同ECJ组；假手术组：只手术但不阻断MCA。

2.2 动物模型制作：参照Longa[5]线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。4%水合氯醛（100 mg·kg-1）腹腔注

射麻醉小鼠后，分离右侧颈总、颈内及颈外动脉并结扎颈外动脉，在颈内、颈外分叉处剪一小口，将头端烧光滑的渔线插入至MCA起始部，进线深度约为14mm±1mm。实验结束后留取血清和脑，放入-20℃冰箱中冷冻保存，待测血清中NSE、MDA的含量。脑放入-20℃冰箱中速冻15min后制成2mm厚的冠状切片，置于2%TTC磷酸缓冲液中37℃避光恒温孵育30分钟，10%甲醛固定，根据梗死脑组织不着色，正常脑组织着深红色的原理，数码相机拍照后利用图象分析软件测量脑梗死面积。缺血灶体积=∑（An.T），An为各脑片上的缺血灶面积，T为每片脑片的厚度；同样的方法计算整个脑片的体积。计算缺血部分体积占全脑的体积的百分比[6]

3.统计方法 实验数据均以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05认为有统计学意义。

4.结果

4.1 ECJ预处理对小鼠脑梗死体积的影响

见表1,模型组小鼠脑梗死体积显著高于假手术组（P＜0.01）。与 IP 组一样，ECJ预处理在 30 mg·kg-1，60 mg·kg-1可降低MCAO致小鼠脑组织梗死体积百分比的升高。预处理Nim也有类似的结果。

4.2 ECJ预处理对小鼠血清中MDA、NSE影响

表1 ECJ预处理对脑缺血小鼠脑梗死体积的影响（x±s，n=8）

见表2,与假手术组比较，模型组血清中MDA及NSE含量均有显著升高（P＜0.01）。IP和Nim预处理可显著降低血清中 MDA及 NSE 的增高（P＜0.01），在 30 mg·kg-1，60mg·kg-1剂量，ECJ预处理亦可明显降低血清中NSE和MDA含量的升高。

表2 ECJ预处理对小鼠血清中MDA及NSE含量的影响（x±s，n=8）

5.讨论

众多的研究表明一次或多次短暂缺血后,可提高脑组织对随后较长时间缺血及再灌注的耐受力,是机体的一种内源性保护机制[7,8,9]。缺血再灌注损伤与氧自由基的生成有密切关系。MDA是脂质过氧化的共同产物，细胞中MDA的量常可反应机体内的脂质过氧化的程度，间接反映脑细胞受自由基攻击的严重程度和细胞损伤的程度，因此MDA是评价脑缺血再灌注损伤的较好指标之一[9]。

烯醇化酶是糖糖酵解中酶-烯醇化酶的同工酶，普遍存在于生物体细胞浆中，共有5种同工酶。NSE是特异存在于脑神经细胞和神经内分泌细胞的胞浆中，脑组织缺血、缺氧、坏死，神经元细胞膜的完整性发生变化，NSE从细胞内漏至血浆中，引起血浆内浓度增高，故血清中NSE含量的改变可作为中枢神经系统损伤较特异和灵敏的指标。

本研究发现小鼠 MCAO后，脑梗死面积、血清中NSE活性以及自由基代谢产物MDA明显增多，而ECJ预处理与IP类似可显著降了脑梗死面积、血清中的NSE以及MDA的含量。

综上所述，ECJ预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，其机制可能与抑制脂质过氧化有关。

[1]Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioningwith ischemia：a delayof lethal cell injury in ischemic myocardium［J］．Circulation,1986,74（5）：1124-1132.

[2]Kitagawa K,Matsumoto M,Oda T,et al.Free radical generation during brief of cerebral ischemia trigger delayed neuronal death[J].Stroke,1990,35（3）：551-558.

[3]尹明华，洪森荣，邵兴华.山茶花提取物对脑缺血再灌注小鼠学习记忆损伤的改善作用[J].中国行为医学科学，2007,16（12）：1070-1071.

[4]罗胜勇，董六一，范丽，方明，陈志武.山茶花总黄酮对缺血性脑损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2004，8（10）：1157-1159.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke，1989，20：80-91．

[6]Yi Yang,Ashfaq Shuaib,Qiu Li.Quantification of infarct size on focal cerebral ischemia model of rats using a simple and economical method[J].Journal of Neuroscience Methods,1998,84（2）：9-16.

[7]Nadashima M，Niwa M，Twai T，et al.Involvement of free radicals in cerebral vascular reperfusion injury evaluated in a transient focal cerebral sichemia model of rat[J]．Free Radical Biol Med，1999,25（6）：722-729．

[8]Moncayo J, de Freitas GR,Bogousslavsky J,et al．Do transient ischemic attacks have a neuroprotective effect[J].Nerology，2000，54（11）：2089-2094.

[9]Abas F,Alkan T,Goren B,et al.Neuroprotective effects of postconditioning on lipid peroxidation and apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].Turk Neurosurg,2010 20（1）：1-8.

R961 < class="emphasis_bold">文献标识码：A

A

1671-752X（2011）04-0035-02

2011-08-22

于治国（1979-），男，安徽巢湖人，巢湖职业技术学院医学分院助理实验师。

夏万夫）